[发明专利]用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法

说明书

技术领域

   本发明涉及生物技术领域，特别是用于扩增肠道病毒71型（EV71）的一套全面优化的工艺方法。 

背景技术

肠道病毒71型（EV71）是手足口病的重要病原体之一，由EV71感染引起的手足口病并发症较为严重，死亡率相对较高，因此研发EV71病毒相关疫苗是目前预防手足口病的研究热点.目前绿猴肾（Vero）细胞的大规模培养技术相对比较成熟，但在培养EV71病毒方面报导较少，目前有用Cytodex1作为载体培养EV71取得一定进展，但在聚纤维纸片（Fibra disk）载体上尚未报导。

要完善这个工艺首先必须建立在对VERO细胞生理和生长特性的全面认识，以及对EV71感染细胞后的复制机理有全面把握。首先，细胞感染病毒前后会发生各种变化，如细胞干重、蛋白和核酸（DNA）含量、细胞大小都有不同程度的增加，Vero在不含血清的培养基中，Vero细胞感染病毒后直径扩大20%左右。在感染24，48小时后，细胞对葡萄糖的消耗以及氨和乳酸的生成量均增加了30%- 100% , 氧气（O₂ ）消耗和三磷酸腺苷（ATP）的生成也有类似的趋势，这可能是因为除了细胞正常生长外，感染的过程需要更多的能量。因此在培养病毒阶段更要注意营养物质的适度补给。一方面及时补充葡萄糖，因为在病毒扩增过程中，一旦葡萄糖耗竭会导致病毒扩增的停止。根据“细胞密度效应”，病毒的产量未必跟细胞密度成正比，当细胞密度大于某个数量级，病毒产量不再增加，其原因可能与单位体积内营养物质的争夺和代理产物毒性有关。在EV71扩增的过程中，之前的工艺摸索发现细胞密度在超过8×10⁶个/ml后，病毒滴度将不再有明显成比例增长。 

有基础研究表明，EV71的复制的最短周期大概在20-24小时之间，从与细胞表面受体结合，经过内吞作用进入细胞，然后是DNA的复制、转录和表达以及病毒的组装，这个过程最快一批病毒的产生在20-24小时左右，这一阶段病毒滴度

将会有一个指数级上升，从低不可测到10⁵/ml以上，此外,初始接种病毒细胞数比值即感染复数（MOI）一般在1.0以下,实际上大部分细胞尚未被感染，病毒可以通过细胞连接或释放到细胞外,再次吸附两种方式再次感染细胞，在无血清培养基下让病毒继续吸附感染正常细胞将最终有利于病毒总体滴度的提高。由于在病毒培养阶段最好用不带有任何血清的培养基，因此探索一种较为廉价的无血清培养基非常关键。水解乳蛋白是一种安全有效的培养基添加剂，已有广泛的使用，在扩增EV71病毒中目前尚无报导使用，如何确定其添加成分在培养基中的浓度比例是一个值得摸索的方向。

发明内容

本发明的目的是要最大程度优化肠道病毒71型（EV71）的生物反应器扩增工艺，已期获得更高滴度的肠道病毒71型（EV71），并且稳定该工艺，达到重复性好，稳定性高的特点，最终能用于肠道病毒71型灭活病毒疫苗的生产。

本发明以聚纤维纸片（Fibra disk）为载体，利用生物反应器扩增非洲绿猴肾（Vero）细胞，从而建立EV71复制扩增的全套工艺流程。本方法建立在对EV71复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基，培养细胞第六天换液成无血清培养基，吸附肠道病毒71型病毒2.5-3.5小时，加入3-5%胎牛血清，继续培养22小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液（PBS）冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加0.5%水解乳蛋白，静止再吸附2小时利于更多细胞均匀感染病毒，另外，接种病毒后每24小时添加2g/L的葡萄糖, 该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，使优化工艺达到较高的病毒滴度。 

本发明用生物反应器扩增EV71的优化工艺方法，具有如下步骤：1）在生物反应器内加入生长液，接种VERO细胞，批次换液培养5-6天，密度达到6×10⁶个/ml以上，接种EV71，34℃静止吸附3小时，连续培养扩增病毒，每24小时左右批次换液收获；（2）72-96小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于2g/L，共收获上清15-20L；（3）用膜包（millipore Pellicon XL）浓缩20-50倍，用于进一步纯化。

本发明的技术方案为：应用生物反应器全面优化EV71大规模扩增工艺，其具体包括如下步骤：

准备材料：

 微载体：Fibra disk 纸片载体150g；