[发明专利]用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法

权利要求书

1.一种用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于该方法以聚纤维纸片为载体,利用生物反应器扩增非洲绿猴肾细胞，在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基，培养细胞第六天换液成无血清培养基，吸附肠道病毒71型病毒2.5-3.5小时，加入3-5%胎牛血清，继续培养22小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加0.5%水解乳蛋白，静止再吸附1.5-2.5小时利于更多细胞均匀感染病毒，接种病毒后每24小时添加2g/L的葡萄糖,使优化工艺达到较高的病毒滴度。

2. 根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于具有如下步骤：1）在生物反应器内加入生长液，接种绿猴肾VERO细胞，批次换液培养5-6天，密度达到6×10⁶个/ml以上，接种肠道病毒71型，34℃静止吸附2.5-3.5小时，连续培养扩增病毒，每24小时左右批次换液收获；（2）72-96小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于2g/L，共收获上清15-20L；（3）用膜包浓缩20-50倍，用于进一步纯化。

3.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于生物反应器所用聚纤维纸片载体为150克。

4.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于肠道病毒71型接种量即感染复数MOI为0.5,即病毒颗粒数和细胞数比值。

5.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于接毒后收获方式采用批式收获或连续灌注收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为48、72、96和120小时。

6.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于生物反应器设定参数：（1）细胞培养阶段pH7.0-7.6、温度37℃、溶氧50-80%、搅拌速度50-60rpm；（2）接毒后，pH7.2-7.3、温度34℃、溶氧50-70%、搅拌速度50-60rpm。