[发明专利]一种促肝细胞生长活性肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种促肝细胞生长活性肽的制备方法。

背景技术

促肝细胞生长活性肽，是一种小分子的活性肽，是从健康的乳牛的肝脏中提取的小分子肽类物质，具有促进肝脏细胞DNA合成和有丝分裂，促进肝脏细胞的修复的功能，尤其是对由于肝炎、肝硬化及肝脏手术后的肝细胞再生和肝功能恢复效果明显。

最早在1975年，Labrecgue等就报道了大鼠肝脏提取液具有促进肝细胞再生的功能，后来经过研究证实，这类能促进肝细胞再生的物质为三类不同分子大小的蛋白质，分别是大分子量的(大于11万道尔顿)、中等分子量(2-6万道尔顿)和小分子量的(小于2万道尔顿)，人们将其命名为肝细胞生长因子(HGF)，可以被乙醇等有机溶剂所沉淀，一般都做成注射剂使用，其他给药途径都不理想，但由于它分子量较大，吸收效果不佳，刺激效果差。如已经公开的专利CN1279974C、CN1762383等都属此类。也有将此类物质制成口服制剂的，由于其分子量较大，口服吸收效果差，如CN1628843、CN1146896等。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有促进肝细胞再生的物质制剂吸收效果差、稳定性差的问题，而提供一种促肝细胞生长活性肽的制备方法。

本发明的促肝细胞生长活性肽的制备方法是按以下步骤进行的：

一、原料预处理：取新鲜的健康乳牛肝脏，剔去血管、筋膜，用纯化水冲洗掉表面血迹，沥去水分；

二、低温水抽提：在0℃～4℃下用胶体磨将步骤一中处理后的乳牛肝脏进行匀浆，并加入等体积的4℃纯化水，在温度为0℃～4℃的条件下，采用超声波破碎机以超声频率为25000Hz超声处理15min，然后在温度为0℃～4℃的条件下放置2h，得抽提物；

三、热处理：将步骤二得到的抽提物通过水浴以1～2℃/min的升温速度升温至80℃～82℃，并保温15min，然后冷却至20℃～30℃；

四、离心：将步骤三热处理后的抽提物在3500r/min的条件下离心15min，收集上清液；

五、超滤：用截留分子量为10000道尔顿的超滤器对步骤三收集的上清液进行超滤透析，收集小于10000道尔顿分子量的上清液，再用截留分子量为5000道尔顿的超滤器对收集小于10000道尔顿分子量的上清液进行超滤透析，收集小于5000道尔顿分子量的上清液，备用；

六、减压浓缩：将步骤五收集的小于5000道尔顿分子量的上清液，导入减压浓缩罐中，在温度为55℃～60℃、压力为150Pa的条件下进行减压浓缩至三分之一体积，得到浓缩液；

七、超滤透析：用截留分子量为1000道尔顿的超滤器对步骤六得到的浓缩液进行超滤透析，其中，透析液为纯水，透析液体积为浓缩液的两倍，收集大于1000道尔顿分子量的上清液，即得促肝细胞生长活性肽溶液；

八、促肝细胞生长活性肽粉制备：将步骤七得到的促肝细胞生长活性肽溶液加入到真空干燥机中，在温度为55℃～60℃、压力为150Pa的条件下，干燥2～4h，即得促肝细胞生长活性肽粉，即得促肝细胞生长活性肽；

其中，促肝细胞生长活性肽作为主药，制成注射剂型药物或口服剂型药物。

本发明包含以下有益效果：

本发明以出生一个月内未断奶的健康的乳牛肝脏为原料提取的，含有一类促肝细胞生长小分子多肽类物质，其主要分子量分布为1000～3500，其吸收效果好，按照促肝细胞生长素活性测定法(MTT法)测定，其刺激指数应在4-6之间。具有很强的促进肝细胞再生功能，而且在70％乙醇中稳定，不被乙醇沉淀，具有较强的稳定性。

附图说明

图1为促肝细胞生长活性肽溶液高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的促肝细胞生长活性肽的制备方法是按以下步骤进行的：

一、原料预处理：取新鲜的健康乳牛肝脏，剔去血管、筋膜，用纯化水冲洗掉表面血迹，沥去水分；

二、低温水抽提：在0℃～4℃下用胶体磨将步骤一中处理后的乳牛肝脏进行匀浆，并加入等体积的4℃纯化水，在温度为0℃～4℃的条件下，采用超声波破碎机以超声频率为25000Hz超声处理15min，然后在温度为0℃～4℃的条件下放置2h，得抽提物；

三、热处理：将步骤二得到的抽提物通过水浴以1～2℃/min的升温速度升温至80℃～82℃，并保温15min，然后冷却至20℃～30℃；