[发明专利]一种检测乙肝肝癌前病变标志物ELISA试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种ELISA试剂盒及应用，具体涉及一种检测乙肝肝癌前病变标志物ELISA试剂盒及应用，属于医药卫生领域。

背景技术

近年统计表明，我国原发性肝癌死亡率为20.40/10万，占恶性肿瘤死亡率的次位，约占全世界肝癌死亡人数的45%。尽管我国肝癌的一级预防已采取了包括乙肝疫苗在内的多项措施，但其效果尚需等待几十年。因此，肝癌的早期发现、早期诊断与早期治疗的二级预防尤为重要。

我国从1971年开展甲胎蛋白（AFP）自然人群普查，但效果不理想。八十年代根据流行病学调查结果，对肝癌高危人群进行划分，使肝癌普查转为对高危对象普查。我国对肝癌流行因素的研究表明：危险因素为HBV感染与肝癌家族史，国外的流行病学调查也提示HBV是肝细胞癌（HCC）的发生的对立致病危险因素。

“上海肝癌高危人群监测方案”对高危对象，每6个月作一次AFP与实时超声检查，结果说明可使无症状体征的小肝癌检出率提高34倍，由此汤钊猷在国际上最早系统提出“亚临床肝癌”的概念和理论，使肝癌的手术患者5年生存率达到61.3%。

但是“亚临床肝癌”仍然是小肝癌，只是尚未出现临床症状，而癌前病变是机体在多种致癌因素作用下，开始启动癌变过程，如何诊断这一阶段病变，尚未见报道。因而高危对象，癌前病变，临床小肝癌，是疾病发展的不同过程。

AFP是第一个用于随访肝癌的肿瘤标志物，1956年首次被发现，1964年发现肝细胞癌患者血中可检得AFP，直至六、七十年代反复验证，AFP检测在全世界普及，成为诊断肝癌的重要标志物，由于AFP检测对肝癌诊断阳性率只有60%-80%，且AFP是肝肿瘤标志物，一旦AFP持续进行性升高，即为肝癌已形成，所以AFP不能作为肝癌前病变的诊断指标。

乙肝是肝癌的高危因素，其致癌机制主要定位在X基因上，其具有反式转录激活作用，能广泛激活病毒和细胞启动子的转录，因此可能干扰宿主细胞生化代谢，影响细胞基因的正常表达而诱发HCC。

早期肝癌病变检出并不是对高危人群防治的最终目的，肝癌是一种进行性发展的疾病，即使是早期发现，如无有效的治疗，患者仍难免因肿瘤的发展而死亡，因而早期防治，提高生存率才是目的。

由于AFP检测对肝癌诊断阳性率只有60~80%，且不能进行癌前病变诊断，使临床二级预防不能进行癌前阻断治疗研究。采用对肝癌高危对象进行肝癌前相关抗体、AFP同时检测，进一步分析两者对早期肝癌诊断，尤其是肝癌前病变的诊断价值，试图通过分析，使AFP的小肝癌的早期发现，提前到癌前病变阶段，这样为寻求尽早阻断癌前病变提供时机。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒及应用，对高危病人血清用这种简单ELISA方法，可以在肝癌发生数年或数月前，可检测到一种或多种抗体的表达。一旦在慢性乙型肝炎患者中检测到多个抗体，尤其是URG11和URG19出现，提示患者可能在数月或数年后发生肝癌，因而密切加强随访与监测（包括影像与组织学），为更早期的干预提供了诊断依据；由于这种特异的ELISA方法，将可用于临床肝癌前抗体诊断，可使血清AFP早期肝癌的诊断提前到癌前病变。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒，该试剂盒是采用固相免疫试验ELISA来检测肝癌前病变抗体，在X基因阳性与阴性的HepG2细胞系中，通过抑制性cDNA差减杂交，克隆出异常表达的基因片段URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2，并选择亲水端序列，固相合成人工多肽，作为包被抗原，制成检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒，URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2的基因序列见序列表；

一种检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒的建立方法，该建立方法包括下列步骤：

（一）建立HBX和CAT的HepG2系

   将HBX基因转染到HepG2中，对照组用氯霉素乙酰转移酶（CAT）转染到HepG2，建立