[发明专利]一种检测乙肝肝癌前病变标志物ELISA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒，其特征在于：该试剂盒是采用固相免疫试验ELISA来检测肝癌前病变抗体，在X基因阳性与阴性的HepG2细胞系中，通过抑制性cDNA差减杂交，克隆出异常表达的基因片段URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2，并选择亲水端序列，固相合成人工多肽，作为包被抗原，制成检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒，URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2的基因序列见序列表。

2.一种检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒的建立方法，其特征在于：该试剂盒的建立方法包括下列步骤：

（一）建立HBX和CAT的HepG2系

   将HBX基因转染到HepG2中，对照组用氯霉素乙酰转移酶CAT转染到HepG2，建立HepG2-X细胞和HepG2-CAT两个细胞系，培养，传代，观察其表达；首先提取HepG 2-X 和HepG 2-CAT总RNA及mRNＡ，ＲＴ－ＰＣＲ反转录建立ｃＤＮＡ文库，用抑制性ｃＤＮＡ差减杂交，ｃＤＮＡ探针的克隆及测序；

   （二）建立ELISAs检测方法

从HepG2-X细胞和HepG2-CAT细胞系克隆出6个基因蛋白：URG4、URG7、URG11、   URG12、URG19和DRG2，ELISA检测每一个基因蛋白相对应的抗体，称之为肝癌前病变抗体；方法是采用固相合成的人工多肽，序列选择跨越亲水区域，人工多肽由分子生物实验室合成，多肽分别用载体蛋白钥孔戚血兰素偶连，配成一定浓度的人工多肽；

建立一定方法的ELISA：分实验组与对照组，实验组包被用人工多肽，对照组用PBS：Phosphate Buffered Saline，检测中设立阳性对照与阴性对照，阳性对照是用专门的兔抗人工合成多肽血清，阴性血清是从公司购买；

（三）特异性及放射免疫沉淀检测

    为检测建立的ELISA方法的特异性，在ELISA实验前将抗体阳性的血清与相关、或不相关的人工多肽混合在一起，然后加入预先包被的同样人工多肽的培养液中，以观察混合不同浓度人工多肽的阳性血清标本与包被同样人工多肽的结合情况，来分析其特异性；

将URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2全长cDNA分别被亚克隆到pcDNA3；每个重组体在体外成线性转录，然后在兔网织红细胞裂解物中翻译，用35S蛋氨酸标记和35S半胱氨酸标记结合用放射自显影SDS/PAGE检测。

3.一种检测乙肝肝癌前病变标志物ELISA试剂盒的应用，其特征在于：所述的试剂盒在检测乙肝肝癌前病变标志物的应用。