[发明专利]一种高效快速测定BAC末端序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高效快速测定BAC末端序列的方法。

背景技术

基因组BAC(Bacterial Artificial Chromosome,细菌人工染色体)文库是含有某种生物体基因组随机片段的重组DNA克隆群体，它在构建物理图谱、基因图位克隆、基因结构分析等研究中具有重要作用。目前许多生物都有高覆盖度的BAC文库。为了方便管理，BAC文库被划分为多个超级池来储存，每个超级池由一定数目的96孔或384孔板组成；在每个超级池中，再将行向、列向和板面的BAC克隆混合，即得到行池、列池和板池。筛选克隆常用3D-PCR筛选系统，第一步是对超级池的DNA进行PCR扩增，找出含有阳性克隆的超级池；接下来对行池、列池和板池的DNA进行PCR扩增，得到克隆所在的行、列、板三个方向信息。由此，两步PCR就可以找到含有目的片段的BAC克隆。

BAC末端序列是指BAC克隆中插入片段的两端序列，能够迅速而精确的定位BAC在基因组上位置。BAC末端测序技术在全基因组测序中有着举足轻重的作用，它能够迅速而精确地进行序列拼装，也可以用来确定基因组序列结构的多态性，如倒置和易位。在许多基于新一代测序的动植物de novo基因组拼接中利用了BAC末端序列的长程（约100-150kb）的位置关系，辅助基因组的拼接。在白菜基因组的de novo测序中，研究者利用BAC末端序列的信息将Scaffold N50从500kb提高到2Mb，显示了这一应用的潜力。

目前BAC末端测序都是基于Sanger技术的，与质粒或PCR产物的测序步骤相近，但成功率却比它们低得多，主要是由于难以获得大量高纯度的BAC DNA(500ng以上)，而且操作复杂、通量低、成本高。若以一个含10万个克隆的大基因组的BAC文库计算，每对BAC末端测序需要50元，则测出所有BAC末端序列需要10万×50元/克隆＝500万元，更别说所需要的时间。因此，发明一种快速低成本地测序BAC文库中所有BAC末端序列的方法是非常有必要的和有市场前景的。

除此之外，高效快速测定BAC末端序列的方法可以用于全基因组测序的组装工作中。近些年来，基于各种新一代测序平台的denovo基因组测序为我们提供了成千上万个物种的参考基因组序列，但短的序列读长增加了de novo数据的组装难度，拼接后的contigN50一般在15-40kb。为此，开发一种高效利用已有BAC文库中所有BAC末端序列来辅助基因组组装的方法，是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效快速测定BAC末端序列的方法，所述方法通过新一代测序平台大规模平行测定BAC文库中行池、列池和板池中所有的BAC末端序列，再通过生物信息学的方法将BAC末端序列回归到单个克隆。

本发明所述的高效快速测定BAC末端序列的方法包括如下步骤：

（1）以超级池为单位，富集每个超级池中的行池、列池和板池中所有BAC末端序列，制备成适合新一代测序平台所需的文库；

（2）在新一代测序平台上进行测序；

（3）通过生物信息学的方法将混合的BAC末端序列回归到单个克隆：利用序列比对，确定每个BAC末端序列所在的行池、列池和板池信息，定位出每个克隆的BAC末端序列。

其中，步骤（1）的方法为：用Covaris S220超声破碎系统将超级池的行池、列池和板池中BAC DNA分别打断成400-500bp，经过末端修复后，在DNA两端连接上特定接头，再通过特异的PCR引物扩增含BAC末端序列的区域，纯化并胶回收300-350bp扩增产物，即制成含所有BAC末端序列的测序文库。

具体地，步骤（1）中制备上述含所有BAC末端序列的测序文库的方法包括如下步骤：

（A1）将BAC DNA打断：在1.5ml离心管中加入5μg BACDNA，用TE溶液稀释将其体积补充至130μL，把稀释好的DNA缓慢注入Covaris microTube，注意不要引入气泡；设置Covaris S220参数，将DNA打断成400-500bp；

（A2）末端修复：配制末端修复反应的体系，混匀，室温放置20min，反应结束后，用1.8×AMPure XP Beads纯化，50μL TE溶液洗脱；

（A3）连接接头：配制连接接头反应的体系，混匀，室温放置30min；反应结束后，用1.8×AMPure XP Beads纯化，30μL TE溶液洗脱；