[发明专利]一种高效快速测定BAC末端序列的方法

权利要求书

1.一种测定BAC末端序列的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）以超级池为单位，富集每个超级池中的行池、列池和板池中所有BAC末端序列，制备成适合新一代测序平台所需的文库；

（2）在新一代测序平台上进行测序；

（3）通过生物信息学的方法将混合的BAC末端序列回归到单个克隆：利用序列比对，确定每个BAC末端序列所在的行池、列池和板池信息，定位出每个克隆的BAC末端序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）的方法为：用Covaris S220超声破碎系统将超级池的行池、列池和板池中BAC DNA分别打断成400-500bp，经过末端修复后，在DNA两端连接上特定接头，再通过特异的PCR引物扩增含BAC末端序列的区域，纯化并胶回收300-350bp扩增产物，即制成含所有BAC末端序列的测序文库。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中制备上述含所有BAC末端序列的测序文库的方法包括如下步骤：

（A1）将BAC DNA打断：在1.5ml离心管中加入5μg BACDNA，用TE溶液稀释将其体积补充至130μL，把稀释好的DNA注入Covaris microTube，设置Covaris S220参数，将DNA打断成400-500bp；

（A2）末端修复：配制末端修复反应的体系，混匀，室温放置20min，反应结束后，用1.8×AMPure XP Beads纯化，50μL TE溶液洗脱；

（A3）连接接头：配制连接接头反应的体系，混匀，室温放置30min；反应结束后，用1.8×AMPure XP Beads纯化，30μL TE溶液洗脱；

（A4）特异性PCR富集BAC末端序列：配制PCR反应的体系，设置好程序进行PCR扩增反应；反应结束后，用1.5×AMPure XPBeads纯化，30ul TE溶液洗脱，胶回收300-350bp扩增产物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（A1）中设置的Covaris S220参数为：

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（A2）中配制的末端修复反应体系如下：

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（A3）中配制的连接接头反应体系如下：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（A3）中所述接头为：核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条序列，将它们等摩尔混合，退火形成双链，即制成接头。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（A4）中配制的PCR反应体系如下：

引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（A4）中PCR反应程序如下：先95℃预变性5min；然后95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；再72℃延伸10min；4℃保存。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述新一代测序平台为Ion Torrent PGM测序仪、Ion Torren Proton测序仪、Illumina公司的HiSeq、GA、MiSeq测序仪或Roche公司的454测序仪中的一种。