[发明专利]一种地特胰岛素的纯化方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种地特胰岛素的纯化方法，属于生物化学、药物化学领域。

背景技术

糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一大疾病。在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加快，糖尿病的患病率呈快速上升趋势，在2010年中国糖尿病患者总数已突破9000万人。糖尿病的急慢性并发症，尤其是慢性并发症累计多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。

所有Ⅰ型糖尿病患者都须接受胰岛素治疗，大多数Ⅱ型糖尿病患者随着病程进展，最终也须使用胰岛素控制血糖。现有证据表明,糖尿病患者一旦具有开始胰岛素治疗的指征，就应尽早启动胰岛素治疗，这样可以使血糖得到更持续、稳定、良好的控制，在很大程度上减少并发症的发生。

然而，频繁地注射胰岛素，给糖尿病患者带来诸多不便和痛苦，临床上需要注射间隔时间更长的长效胰岛素。近年来，随着胰岛素技术的不断发展，人们开发出了具有不同作用时间的新一代胰岛素及胰岛素类似物。其中长效胰岛素类似物正在越来越多地被医生和患者所接受和使用。理想的胰岛素替代治疗应尽可能模拟健康人群生理状态下的胰岛素分泌模式，长效胰岛素的理想效果是通过尽可能少的胰岛素注射次数，在糖尿病患者体内重建胰岛素基础分泌，而地特胰岛素正是这样一种模拟生理模式的基础胰岛素类似物。

地特胰岛素是诺沃挪第克公司利用基因工程重组人胰岛素研制的一种新型长效可溶（避免了非溶性胰岛素的常见副作用）胰岛素类似物。它的结构式如下：

即在去掉了B30位氨基酸残基的人胰岛素类似物的B29位Lys的ε-氨基连接了一个十四烷基脂肪酸（肉豆蔻酸）侧链，其中去B30重组人胰岛素和十四烷基脂肪酸（肉豆蔻酸）侧链以酰胺键的形式相连。

在现有技术中，地特胰岛素及其它脂肪酸链修饰的胰岛素类似物的制备纯化基本上都是采用了反相高效液相色谱的方式。伊莱利利公司(中国专利CN95196266.3)公开了一种采用C4反相高效色谱柱的纯化方式；康久化学生物技术公司（中国专利，CN200480021270.5）公开了一种采用phenomenex luna phenyl-hexyl反相色谱柱的纯化方式；从已有的文献资料可以看到通过反相高效液相色谱的纯化能够得到产品，但是这种纯化方式对于设备的要求较高，需要整套能够耐受高压的色谱系统，而且制备过程中会使用大量的乙腈等有机试剂，成本较高而且不环保；样品在反相制备柱上的吸附较强，导致回收率不高，且容易对反相制备柱造成不可逆的损坏。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本更低、回收率更高、操作更方便的地特胰岛素的纯化方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种地特胰岛素的纯化方法，其特点是：所述的原料是由去B30的重组人胰岛素和十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯一步反应制得的地特胰岛素溶液；纯化采用离子交换层析方法进行，其步骤如下：

（1）采用氯化钠浓度低于50mM、pH值为2-4的酸性缓冲液平衡阳离子交换柱4.5-5.5CV，并用前述酸性缓冲液或用同体系的稀酸将地特胰岛素溶液调节至pH值<5，得样品溶液；

（2）将样品溶液上到阳离子交换柱上，此时十四烷基脂肪酸-N-琥珀酰亚胺酯不挂柱，会流穿出来，然后用平衡缓冲液冲洗阳离子交换柱2.5-3.5CV；

（3） 采用氯化钠浓度为0.5-1.0M 、pH值为2-4的酸性缓冲液线性梯度洗脱的方式将吸附在柱子上的各种物质依次洗脱下来，收集主峰即得目的产物地特胰岛素。

本发明所述的地特胰岛素的纯化方法中，进一步优选的技术方案或者技术特征是：

1．所述的酸性缓冲溶液的pH值优选为3-3.5。

2．所述的酸性缓冲溶液优选为醋酸钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液。

3．步骤（1）所述酸性缓冲溶液优选为氯化钠浓度是10-50mM的醋酸钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液。最优选的缓冲溶液是的10mM pH3.0的柠檬酸钠缓冲液。

4．离子交换层析使用的离子交换树脂优选自SP Sepharose F.F.、SP Sepharose H.P.、S Sepharose F. F.、Capto S、Source 15S、Source 30S或Capto SP ImpRes。

本发明地特胰岛素的纯化方法，是利用在地特胰岛素的合成粗品中，去B30重组人胰岛素和脂肪酸修饰剂反应生成的各种修饰产物以及原料在特定的溶液体系下带电荷数目等性质的差异来进行纯化的。