[发明专利]制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的多聚物制备方法，具体是一种制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的方法。

背景技术

经微纳米珠连接单根多聚物（DNA、RNA、蛋白质和肽核酸等）分子进行单分子操纵，可用于检测多种生命现象的单分子基本行为，包括核酸与核酸、核酸与相关蛋白相互作用动力学、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代测序仪的样品制备等。比较常用的办法是采用光学镊和磁镊操纵连接单分子多聚物的微纳米珠，但如何快速和简便制备这种单个微纳米珠连接单根多聚物分子，一直没有很好解决。

经对现有文献检索发现，Dapprich,J.&Nicklaus,N.等在《生物成像》上发表了“通过监控珠子位移将DNA连接到被光学捕获在微结构的珠子上”一文（Dapprich,J.&Nicklaus,N.DNA attachment to optically trapped beads in microstructures monitored by bead displacement.Bioimaging,6:25-32,1998），文中称他们的研究结果可获得一个磁珠只连接一根DNA片段，但该方法需要光学镊，步骤比较繁琐，效率也较低。因此，本发明要解决的技术问题是提供快速、简便制备并富集大量的“单个微纳米珠携带单根多聚物分子”（以下称“目的复合物”）的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速、简便制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的方法，用于在单分子水平研究核酸与相关蛋白分子相互作用动力学、遗传诊断、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代测序仪的样品制备等。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种制备与富集单个微纳米珠连接单根多聚物分子的方法，该方法在获得连接单根荧光标记的多聚物分子的单个微纳米珠（目的复合物）和空微纳米珠的混合物后，采用一内部有溶液通道的流室，该流室溶液通道上游有进样口和电泳缓冲液填充口；将混合物通过进样口注入流室，同时将电泳缓冲液通过电泳缓冲液填充口注入流室，流室下端有目的复合物收集口和空微纳米珠出口；将连接复合物收集口的目的复合物收集容器连接到电源正极，与目的复合物收集容器对应的流室溶液通道另一处连接到电源负极，利用外加电场，使携带净负电荷目的复合物进入目的复合物收集容器。

本发明方法中，所述获得连接单根荧光标记的多聚物分子的单个微纳米珠（目的复合物）和空微纳米珠的混合物，可以采用现有技术制备，也可以按照以下方法制备：

步骤一，在多聚物（包括DNA、RNA、以及二者之一与蛋白质或肽核酸连接后的嵌合体）一端标记一种活性基团，另一端或侧链标记荧光分子，纯化后用连接缓冲液重新溶解；

步骤二，采用可与标记核酸活性基团发生反应的另一种活性基团包被的微纳米珠与经步骤一处理过的多聚物混合，通过连接反应将多聚物分子连接到微纳米珠上。为使一个微纳米珠连接的多聚物分子不超过一根，多聚物分子数目与微纳米珠数目的比例按1：≥10混合，结果是一个微纳米珠上要么只连接一根多聚物分子，要么不连接多聚物分子，没有连接一根以上的微纳米珠，因微纳米珠数目大大超过多聚物分子数，所以，反应后也没有自由的多聚物分子。

本发明方法中，对于在中性溶液中携带负电荷的核酸分子，可直接按上述步骤实施，对蛋白质和肽核酸等多聚物分子，则需要事先连接一段核酸作为电分离的介体，形成多聚物嵌合体。

所述的荧光标记，是可以用于荧光显微镜观察的一类荧光分子。

所述的多聚物分子，是核酸（DNA和RNA）、核酸与蛋白质以及核酸与人工合成的肽核酸多聚物连接后的嵌合体。

所述的微纳米珠，是单分子多聚物运载工具，其材质可以是硅、磁性材料或多聚物等，其直径在纳米至微米量级。

所述的标记多聚物分子和包被微纳米珠的活性基团，是二者能够发生免疫绑定、直接或介导形成共价键的活性基团对，凡是能够实现该目的的活性基团对均可，包括但不限于：生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-环氧基、氨基-羧基（包括羧基的活化形式如琥珀酰亚胺碳酸酯等）、氨基-羰基、巯基-马来酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等。包被微纳米珠表面的活性基团可以是中性、酸性或碱性，后两种情况下，连接产物在分离与富集前，用能使之钝化的试剂处理微纳米珠，使微纳米珠表面不携带净电荷。