[发明专利]基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法及试剂盒。

背景技术

我国是食品消费和生产的世界第一大国，食品安全是重大的民生问题，是国家和人民密切关注的话题。然而近些年我国的食品安全事故频繁发生，食品安全问题已然成为国人心中挥之不去的梦魇。据调查，让人不安的食品安全是导致民众幸福指数较低的主要原因。食源性疾病是食品安全的最大问题，给消费者健康和安全带来严重威胁。食源致病菌是引起食源性疾病的主要致病因子。2011年10月，上海家乐福超市的思念牌三鲜水饺被检出含有金黄色葡萄球菌，该细菌很可能会导致肺炎。2012年4月，广东有两批次婴儿配方奶粉被检出含有阪崎肠杆菌，该病菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和败血症，死亡率高达50%以上。2012年11月，国家质检总局组织了产品质量国家监督抽查，福建省的扭扭虾味条大肠菌群实测值是标准值的100倍以上。食源致病菌一直难以得到及时有效的监控，不仅对食品卫生和人民健康构成严重威胁，也对食品工业和国民经济造成很大的影响。因此，发展一种快速、灵敏、特异、安全的检测食源致病菌的方法对食品安全体系的完善、预防人类食源性疾病的发生具有重要意义。

传统的食源致病菌的检测方法主要有培养鉴定法、电子显微镜观察法、免疫学检测方法等。培养鉴定法的操作烦琐，需时较长，而其他方法具有灵敏度低、特异性不高、耗时长、需要昂贵仪器等缺点。传统的方法在相当程度上限制了对食源致病菌的快速检测能力，而近年来发展的分子生物学新技术就能够实现高通量、快速、准确的检测，其中核酸扩增技术使得分子检测的灵敏度和准确性大大提高。为了使扩增技术更适应现代分子诊断的需求，许多研究都集中在新的检测技术的开发。试纸条检测技术无疑为分子检测提供了便捷的途径。近期，基于与核酸扩增技术相结合的核酸试纸条发展迅速，其与免疫试纸条相比，具有成本低、应用范围广、灵敏度高、准确性好的特点。

依赖核酸序列扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）是一种特别适合扩增RNA的技术，是由1对带有T7启动子序列的引物引导的灵敏的恒温扩增技术，其产生的大量单链RNA易于在试纸条上实现快速、准确、高灵敏度检测。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于NASBA与试纸条检测结合的快速、灵敏、准确、操作简便的检测食源致病菌的方法。

本发明的另一目的在于提供一种使用上述方法检测单增李斯特菌的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现，基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，具体包括以下步骤：

（1）模板的准备：提取食源致病菌的RNA。

（2）设计合成两条用于扩增食源致病菌保守序列的引物：T7引物和引物2，T7引物中含有能被T7RNA聚合酶识别的T7启动子序列。

（3）NASBA反应：将步骤（1）制备的模板、步骤（2）设计合成的引物进行NASBA扩增反应，得到单链RNA产物。

（4）探针的设计：根据单链RNA产物的序列设计三条捕捉探针，探针1和探针2分别和单链RNA产物的两端互补，探针3与探针1完全互补；三条探针的一端都修饰有功能基团。

（5）纳米金探针的制备：将步骤（4）中所设计合成的探针1与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针。

（6）胶体金核酸试纸条的制备

胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜（NC膜）和吸水板构成，将样品板、金垫、硝酸纤维素膜（NC膜）和吸水板依次搭接固定于底板上（如图5所示结构）组装得到胶体金核酸试纸条。

所述的金垫包埋有步骤（5）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线（C线）和含链霉亲和素和探针2的检测线（T线），检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板。

（7）检测：将由步骤（3）得到的RNA产物与含甲酰胺（甲酰胺能够破坏RNA的二级结构，从而提高其与探针的杂交效率）的SSC缓冲液（柠檬酸钠缓冲液）混合，混合液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加SSC缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶序列存在，即有待测食源致病菌，仅有控制线变成红色表明没有待测食源致病菌。