[发明专利]基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于包括如以下步骤：

（1）模板的准备：提取食源致病菌的RNA；

（2）设计合成两条用于扩增食源致病菌保守序列的引物：T7引物和引物2，T7引物中含有能被T7RNA聚合酶识别的T7启动子序列；

（3）NASBA反应：将步骤（1）制备的模板、步骤（2）设计合成的引物进行NASBA扩增反应，得到单链RNA产物；

（4）探针的设计：根据单链RNA产物的序列设计三条捕捉探针，探针1和探针2分别和单链RNA产物的两端互补，探针3与探针1完全互补；三条探针的一端都修饰有功能基团；

（5）纳米金探针的制备：将步骤（4）中所设计合成的探针1与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针；

（6）胶体金核酸试纸条的制备

胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板依次搭接固定于底板上组装得到胶体金核酸试纸条；

所述的金垫包埋有步骤（5）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线和含链霉亲和素和探针2的检测线；

（7）检测：将由步骤（3）得到的RNA产物与含甲酰胺的柠檬酸钠缓冲液混合，混合液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加柠檬酸钠缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶序列存在，即有待测食源致病菌，仅有控制线变成红色表明没有待测食源致病菌。

2.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的食品致病菌包括单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和蜡状芽孢杆菌；

步骤（2）中所述的食源致病菌保守序列为食源致病菌16S rRNA基因的可变区序列或毒力基因片段；

步骤（2）中所述的T7启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGGAGA。

3.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的NASBA反应的体系包含：模板RNA、AMV逆转录酶、AMV逆转录酶缓冲液、T7RNA聚合酶、T7RNA聚合酶缓冲液、RNaseH、RNA酶抑制剂、T7引物、引物2、dNTPs、NTPs、牛血清白蛋白、DMSO和DEPC处理水；所述的T7引物的终浓度为300～500nM；所述的引物2的终浓度为300～500nM；

步骤（3）中所述的单链RNA产物的长度为120～270nt。

4.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于：

步骤（3）所述的NASBA反应的条件为每25μL反应体系的组成如下：模板RNA1ng/μL、T7引物400nM、引物2400nM、AMV逆转录酶8U、AMV逆转录酶缓冲液、T7RNA聚合酶36U、RNA酶抑制剂10U、RNaseH5U、NTPs2mM、dNTPs1mM、DMSO的体积百分比为10%、牛血清白蛋白终浓度为0.1μg/μL；扩增过程为：配制混合液A于65℃加热5分钟，再于41℃冷却5min，加入酶混合液，于41℃孵育90min，4℃终止反应；所述的混合液A包括：模板RNA、T7引物、引物2、dNTPs、NTPs、5×T7RNA聚合酶缓冲液、5×AMV逆转录酶缓冲液、DMSO和DEPC处理水；所述的酶混合液包括：5×T7RNA聚合酶缓冲液、5×AMV逆转录酶缓冲液、AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、RNaseH、RNA酶抑制剂、牛血清白蛋白和DEPC处理水。

5.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于：

步骤（4）中所述的探针1和探针2的长度为20～30nt；

步骤（4）中所述的探针1的功能基团为巯基，探针2和探针3的功能基团为生物素。

6.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于：

步骤（5）中所述的纳米金的粒径为13nm；

步骤（5）中所述的包埋缓冲液为：Na₃PO₄20mM，BSA质量百分比5%，Tween X-100体积百分比0.25%，蔗糖质量百分比8%。