[发明专利]一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基及其构建方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌蛋白A简称蛋白A，是金黄色葡萄球菌表面的一种蛋白质，通过共价键连接到胞壁肽聚糖。蛋白A分子中存在五个同源性很高的E、D、A、B、C序列，由于能和人及多种哺乳动物IgG的Fc段结合，因此称之为抗体结合区。蛋白A与抗体的Fc段结合并不影响抗体对抗原的吸附活性，因此被广泛应用于抗体的亲和纯化。由于B结构域对抗体的结合力最稳定，而且本身结构也最稳定，因此人们对B序列的研究最多。B序列由3个α螺旋和连接螺旋片段的两个Loop组成，按照从N端到C端的顺序依次是Helix1-Loop1-Helix2-Loop2-Helix3。

以蛋白A为亲和配基吸附IgG时结合力很强，需要使用较低pH洗脱液(pH3.0左右)，往往会影响IgG的活性。蛋白A亲和层析柱在使用过程中会在柱内残留核苷酸、变性蛋白质、脂类和微生物等杂质，需要使用在位清洗进行清除，其中NaOH是工业生产中较为廉价和常用的清洗液。天然蛋白A虽然对碱性环境有着较好的耐受性，但是仍然不能满足长期使用强碱对其进行清洗。尽管天然蛋白A抗体结合区的E、D、A、B、C五个结构域彼此之间有很高的同源性，但是它们对IgG的结合能力存在差异，导致最适洗脱条件不一样。

因此，本发明针对以上几点，选取B结构域对天然蛋白A进行分子改造。利用分子生物学方法从核苷酸序列上进行改造和连接，利用大肠杆菌高效表达系统实现高效表达，得到一系列个改造序列串联组成而且C端添加一个半胱氨酸的重组蛋白A，将得到的重组蛋白A作为亲和配基制备亲和层析填料，用于抗体的分离纯化，具备较温和洗脱性能和较高的耐碱性能。

发明内容

本发明的目的是提供一种性能改进的重组金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基，用于抗体制备的亲和层析填料，具有较好的洗脱性能和耐碱性能。

所述的重组蛋白A亲和配基由1到10个Z序列串联构成的一系列蛋白质。Z序列是B序列经过改造后的产物，与B序列的区别在于在Loop2与Helix3之间添加6个甘氨酸，并将第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸分别替换成苏氨酸和丙氨酸，为了实现蛋白A与填料基质更稳定的连接，在B蛋白序列的C端添加了2个半胱氨酸，从而实现与基质实现双位点连接。将表达Z序列的基因命名为z，利用同尾酶将1到10个不同数量的z串联，所表达的重组蛋白A中每两个Z序列均由两个丝氨酸相连接。

所述的性能改进的重组蛋白A亲和配基的构建方法的步骤为：

(1)引物设计

本发明对蛋白A的B片段进行分子改造，根据重叠PCR和同尾酶连接原理设计引物，将改造后的B片段命名为Z，改造内容为Z(6G)的改造、Z(N23T，F30A)的改造、C端半胱氨酸的添加和1到10个z核苷酸序列的拼接，其中Z(6G)的改造是在B序列第二个Loop后面添加6个甘氨酸增加Loop2长度，从而降低其与抗体的结合力强度，使洗脱更容易进行，Z(N23T，F30A)的改造是对B序列的第23、30位的天冬酰胺和苯丙氨酸进行定点突变，分别替换为苏氨酸和丙氨酸，减少B序列的脱酰胺作用，增强对高浓度碱液的耐受性能，C端半胱氨酸的添加是在B序列的C端添加3个半胱氨酸，以实现重组蛋白A亲和配基与琼脂糖填料基质实现双位点连接，在引物中添加Nhe I、Xba I、Noc I和BamH I四个酶切位点，利用同尾酶作用原理将不同个数的z核苷酸序列首尾相连，组成含有不同个数z序列串联的重组蛋白A表达基因；

(2)重组菌的构建

本发明根据步骤(1)所设计的引物，以金黄色葡萄球菌基因组为模板进行重叠PCR，获得所需的目的核苷酸序列z，利用T载体pMD18-T构建重组质粒pMD18-T-z₁，转化感受态E.coli JM109进行甘油冻管保藏，以此为基础进行不同个数z序列(z_n)的构建，然后利用Noc I和BamH I两个酶切位点将构建好的z_n序列与表达质粒pET-28a进行酶切连接，得到重组表达质粒pET-28a-z_n，最后转化感受态E.coli BL21(DE3)，得到重组蛋白A的表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a-z_n，制备甘油冻管保藏备用；