[发明专利]一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖鱼种及水产动物天然种质资源鉴定技术领域，具体涉及一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒，同时还涉及一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类分子的鉴定方法。

背景技术

鳜亚科隶属鲈形目，自然仅分布于东亚（俄罗斯、日本、韩国、中国和越南（红河））。鳜亚科中，翘嘴鳜(Siniperca chuatsi Basilewsky)、大眼鳜(Siniperca kneri Garman)和斑鳜(S iniperca scherzeri Steindachner)为我国主要养殖名贵鱼类,它们生活习性基本相同，外形特征相似。以上三种经济鳜鱼在育种过程中，育苗阶段无法根据形态学鉴别，尤其翘嘴鳜与大眼鳜即使在鱼种和成鱼阶段，形态学手段亦不易鉴别。中国少鳞鳜(Coreoperca whiteheadi Boulenger)和波纹鳜(Siniperca undulate Fang&Chong)为鳜亚科中珍稀种类，肉质细嫩、味道鲜美，苗种阶段均不易鉴别。

微卫星是由2-6个核苷酸组成的具有高度变异性的简单重复DNA序列。它分布于真核生物的整个基因组中，具有等位基因数目多、重复性好、呈共显性遗传等特点，被广泛应用于物种鉴定和基因定位等方面的研究。目前除翘嘴鳜与斑鳜外，尚缺乏采用微卫星分子鉴定法进行五种鳜亚科鱼类鉴定的相关报道。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒，可显著提高鳜亚科重要经济、稀有种类间鉴定的效率和准确性，有助于鳜亚科鱼类遗传资源的保护和鳜鱼养殖业的持续健康发展。运用本试剂盒，可弥补形态学鉴定的不足，解决了水产养殖中三种常见养殖鳜类（翘嘴鳜、大眼鳜和斑鳜）苗种鉴定的难题，解决了鳜亚科珍稀种类（中国少鳞鳜和波纹鳜）种属鉴别的问题，从而促进鳜亚科遗传资源的合理保护和养殖业的健康发展。

本发明的另一个目的是在于提供了一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类分子的鉴定方法，方法易行，操作简便，鉴定效率高、准确性好。该方法运用微卫星分子标记鉴别鳜亚科主要养殖种类（翘嘴鳜、大眼鳜和斑鳜）及珍稀种类（中国少鳞鳜和波纹鳜），以利于鳜亚科养殖群体的合理管理以及野生资源的保护。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒，它包括三对SSR引物和标准图谱，其中用于聚合酶链式反应的三对引物序列分别为：

引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,

引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;

引物2正向序列：5’TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,

引物2反向序列：5’ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;

引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,

引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;

用于鉴别五种鳜亚科鱼类的标准图谱为：

一种引物1扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图（图1）；一种引物2扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图（图2）；一种引物3扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱示意图（图3）。

一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其步骤是：

1）DNA提取：采集待测鳜鱼样品的鳍条或者肌肉组织，提取基因组DNA并测定其纯度和浓度；本步骤中测得DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.82-1.97。

2）DNA片段扩增：采用聚合酶链式反应（PCR）扩增待测样品基因组DNA，扩增引物序列为：

引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,

引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;

引物2正向序列：5’TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,

引物2反向序列：5’ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;

引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,

引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;

本步骤中测得DNA的浓度范围为585.5-3210.4ng/μl。