[发明专利]一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒及鉴定方法

权利要求书

1.一种用于五种鳜亚科鱼类分子的试剂盒，它包括三对SSR引物和标准图谱，其中用于聚合酶链式反应的三对引物序列分别为：

    引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,

引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;

引物2正向序列：5’ TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,

引物2反向序列：5’ ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;

    引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,

引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;

用于鉴别五种鳜亚科鱼类的标准图谱为：

       一种引物1扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱；一种引物2扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱；一种引物3扩增的部分物种鳜亚科鱼类的微卫星带谱。

2.权利要求1所述的一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其步骤是：

    1）DNA提取：采集待测鳜鱼样品的鳍条或者肌肉组织，提取基因组DNA并测定其纯度和浓度；测得DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.82-1.97；

    2）DNA片段扩增：采用聚合酶链式反应扩增待测样品基因组DNA，扩增引物序列为：

    引物1正向序列：5’TACATGCACACCAGTACGG3’,

    引物1反向序列：5’ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’;

    引物2正向序列：5’ TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’,

    引物2反向序列：5’ ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’;

    引物3正向序列：5’ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’,

    引物3反向序列：5’GCATGGATGCCAGCGTGA3’;

本步骤中测得DNA的浓度范围为585.5-3210.4 ng/μl;

PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后按以下条件进行35个循环：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后72℃延伸10min结束，4℃中保存；

    3）PCR产物的电泳及银染色鉴定：对PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，常规银染法染色后，拍照记录电泳结果；采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶；

4）与标准图谱进行对比：使用引物1，样品在靠近标准Marker的300bp位置扩增出1条DNA条带，则鉴定为中国少鳞鳜；使用引物1，在靠近标准Marker的180bp位置扩增出1条特异性条带，鉴定为斑鳜；使用引物2，样品在靠近标准Marker的200bp位置扩增出1条或2条DNA条带，鉴定为波纹鳜；使用引物3，样品在靠近标准Marker的120bp位置扩增出1条DNA条带，鉴定为翘嘴鳜；使用引物3，样品在靠近标准Marker的120bp位置扩增出1条DNA条带，鉴定为大眼鳜。

3.根据权利要求2所述的一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其特征在于：所述的步骤（3）中PCR反应体系为：

根据权利要求2所述的一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其特征在于：所述的步骤（4）中使用引物1和引物2，待测样品为五种鳜亚科鱼类：翘嘴鳜、大眼鳜、斑鳜、中国少鳞鳜及波纹鳜中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的一种试剂盒用于五种鳜亚科鱼类的分子的鉴定方法，其特征在于：所述的步骤（4）中使用引物3时，待测样品为翘嘴鳜或大眼鳜任意一种。