[发明专利]一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法，属于酶工程技术领域。

技术背景

α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)，又称α-D-葡萄糖苷水解酶，来源广泛，能催化水解低聚糖类生成葡萄糖，在动物、植物、微生物的糖类代谢中具有重要的生理功能。其中来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的α-葡萄糖苷酶（AGL）不仅具有水解活性，还具有良好的转苷能力，即从麦芽糖的非还原末端切开α-1,4糖苷键并将游离出的葡萄糖残基转移到其他糖类底物形成α-1,6糖苷键，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖（简称IMOs，主要包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等)。由于IMOs能够促进人体内益生菌的生长繁殖，具有防龋齿、降低胆固醇等作用，已广泛应用在食品和医药行业。

P.pastoris表达系统是一种应用广泛的高效表达外源蛋白的真核表达系统，它不仅克服了E.coli等原核表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、易形成不溶性包涵体等缺陷，而且弥补了昆虫细胞及哺乳类细胞等真核表达系统操作复杂、产业化生产成本昂贵的不足。目前提高外源蛋白在P.pastoris中表达量主要有增加目的基因拷贝数，选择强启动子，密码子优化，共表达分子伴侣以及发酵优化等策略。

发明人前期的研究中以A.niger CICIM F0620总RNA为模板，通过RT-PCR获得α-葡萄糖苷酶cDNA，并在P.pastoris KM71中表达，3L罐表达量为3.51U/mL，较野生型及其它基因工程菌有明显提高，但表达水平仍不足以满足生产需求。因此，进一步提高该酶的表达量对工业化生产α-葡萄糖苷酶是相对有利的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种黑曲霉α葡萄糖苷酶基因，用毕赤酵母偏爱密码子替代稀有密码子，共改变了728个碱基，涉及222个密码子，GC含量由50.0%下降到44.2％。

具体而言，以NCBI数据库中A.niger CBS513.88的α-葡萄糖苷酶序列(NCBI登录号：4991096)为基础根据毕赤酵母密码子偏爱性对原始基因进行了密码子优化，优化后基因aglu^OP核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。优化后基因转化入毕赤酵母KM71菌中在3L罐上甲醇诱导110h后酶活达力到8.2U/mL，是密码子优化前的2.3倍。

本发明还提供一种表达优化后aglu^OP基因的方法，通过共表达二硫键异构酶PDI改善酵母细胞内的折叠环境，实现黑曲霉α-葡萄糖苷酶的高效表达。

所述优化后基因aglu^OP人工合成后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接，酶切鉴定和序列测定获得了重组表达质粒pPIC9K-aglu^OP并转化入毕赤酵母KM71菌中。

pPICZA-pdi重组载体含有二硫键异构酶PDI基因，为本实验前期构建，详见Zhang J,Wu D,Chen J,Wu J(2011)Enhancing functional expression ofβ-glucosidase in Pichia pastoris by co-expressing protein disulfide isomerase.Biotechnology and Bioprocess Engineering16(6):1196-1200。

采用二硫键异构酶与aglu^OP基因共表达的方法，在3L罐上甲醇诱导110h后酶活达力到10.1U/mL，是共表达前的1.2倍，为α-葡萄糖苷酶的工业化生产奠定基础。

有益效果：本发明公开了一种密码子优化后的黑曲霉α-葡萄糖苷酶及其在毕赤酵母中的高效表达方法。所述基因构建到毕赤酵母表达载体并与二硫键异构酶基因转化入毕赤酵母中共表达，在3L罐上诱导110h后酶活达力可到10.1U/mL，是优化前的2.9倍，可用于α-葡萄糖苷酶的工业化生产。

附图说明

图1菌落PCR核酸电泳图（M1为核酸分子量标准，1代表pdi基因）

图2为本发明优化的aglu^OP基因的SDS-PAGE分析，其中M为蛋白分子量标准，1为表达的黑曲霉α葡萄糖苷酶蛋白

图3为本发明优化的aglu^OP基因与PDI在3L罐共表达的发酵酶活曲线

具体实施方式