[发明专利]检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测方法及其试剂盒。

背景技术

β兴奋剂是一种人和兽医作为治疗哮喘的药物。在牲畜中超剂量使用可以将牲畜的脂肪组织转化为肌肉组织，由于能够显著改善脂肪率和生产效率，β兴奋剂往往被滥用于畜牧养殖生产中。近年来已经有沙丁胺醇、妥布特罗、溴布特罗、克伦特罗、西布特罗、马布特罗、特布他林中毒的病例报道。

在β兴奋剂中，沙丁胺醇、妥布特罗、溴布特罗、克伦特罗、西布特罗、马布特罗、特布他林毒性较大，检测这些物质一般将沙丁胺醇与载体合成抗原或半抗原，免疫动物，获得多克隆抗体，可与其他β兴奋剂有交叉反应，进而也可以检测其他β兴奋剂，但是，目前，尚没有一种可以同时检测沙丁胺醇、妥布特罗、溴布特罗、克伦特罗、西布特罗、马布特罗、特布他林这7种β兴奋剂的异性抗体。

传统的试剂盒检测用显色剂一般将它调配成A、B两种液体，当需要显色时就分别加入A和B液，当混合液与实验中复合物反应就会产生显色效果。A液一般由PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300、过氧化氢组成，B液一般由PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300、硫代硫酸钠组成；使用时需要将两种液体按比例混合后才能使用，且两种液体都需要避光保存，使用起来比较麻烦。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒。

本发明的目的还在于提供一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测的方法。

一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：β-兴奋剂特异性抗体、包被有β-兴奋剂特异性抗体的酶标板、β-兴奋剂辣根过氧化物酶标记物、克伦特罗标准品、酶标物稀释液、显色剂、清洗液、终止液和浓缩样品稀释液。

所述显色剂为过氧化氢或过氧化脲，邻苯二胺或四甲基联苯胺与稳定剂K按体积比5∶5∶1混合而成的溶液，稳定剂K、含酶稳定剂AH和酶保护剂均购自美国International Diagostica System公司。

所述的酶标物稀释液为含酶稳定剂AH和酶保护剂KEN的磷酸盐缓冲液。

所述的终止液为2mol/L的盐酸溶液。

所述的浓缩样品稀释液为含1％BSA的5倍浓缩磷酸盐缓冲液。

所述β-兴奋剂特异性抗体是以特异免疫原免疫动物制得，所述特异免疫原是将克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林、马布特罗、溴布特罗、妥布特罗和西布特罗通过戊二醛法交联到载体蛋白上制成。

所述载体蛋白为多聚赖氨酸、牛血清白蛋白、鸡丙种球蛋白、人血丙种球蛋白或卵清蛋白。

所述动物为兔、鼠或羊。

9、一种检测β-兴奋剂类的一步法酶联免疫检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)将试剂于盒外充分恢复至室温，恢复时间为1-5小时；

(2)预先进行编号，标记B₀、标准品和样品的位置，进行双孔检测；

(3)从包被有β-兴奋剂特异性抗体的酶标板上取下所需数量的微孔，将

多余的微孔重新密封并放回2～8℃保存；

(4)将酶标物、浓缩样品稀释液、清洗液根据稀释倍数用蒸馏水配制成工作液；

(5)在B₀孔中加入50μL0.0ng/mL标准品溶液，在各标准孔中加入50μL的标准品溶液，在各样品孔中加入50μL样品溶液；

(6)在所有孔中加入100μL的酶标物，晃动反应1-10s，室温下孵育30min；

(7)倒掉微孔中的液体，在所有微孔中加满清洗液，用微量移液器在每个微孔中加入100μL显色剂，晃动酶标板使之混匀；

(8)室温下显色10min，每孔中加入100μL终止液，混匀；

(9)在450nm下检测吸光度，分析计算检测结果。