[发明专利]检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种研究家蚕蛋白抗细胞凋亡的方法，该方法利用家蚕杆状病毒体外表达系统表达并纯化目的蛋白，通过自建的过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡模型，进而研究目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。

背景技术

目前，对酵母和哺乳动物细胞凋亡的研究越来越多，这些研究成果虽然促进了对昆虫细胞凋亡的研究，但昆虫细胞与酵母和哺乳动物细胞不同，在诱导细胞凋亡的因子、诱导方法和细胞凋亡的检测方面都有很多的不同之处，如病毒感染、紫外线辐射、蛋白质合成抑制剂、脂类信号小分子、重金属离子和植物源农药等都可以诱导昆虫细胞的凋亡，但诱导的条件和检测方法均有很大的差异。同时，昆虫细胞内既有类似于线虫的凋亡信号通路，也有类似于哺乳动物细胞的凋亡信号通路。这些都表明昆虫细胞的凋亡与其他动物细胞存在着一些差异。随着家蚕基因组框架图的完成，关于家蚕细胞凋亡机制的探索已成为研究热点之一，建立适应于昆虫细胞的凋亡诱导条件和检测的方法将具有重要意义。

目前有关家蚕细胞凋亡的研究工作主要集中在对家蚕血淋巴对细胞凋亡的抑制作用，研究结果表明家蚕血淋巴能抑制由多种化学物质，如放线菌素 D、喜树碱和星形孢菌素和丁酸钠诱导的细胞凋亡。大量的研究结果已证实家蚕血淋巴中对昆虫细胞和多种哺乳动物细胞具有凋亡抑制作用的成份即为家蚕30K蛋白。家蚕30K蛋白是家蚕生长发育过程中的主要存储蛋白之一，兼具载脂功能。家蚕30Kc6蛋白为该蛋白家族成员，有研究结果表明该蛋白具有一定抗昆虫细胞凋亡的功能，但由于缺乏适当的昆虫细胞凋亡模型，有关其抗凋亡的作用机制还鲜见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测目的蛋白对抗过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡是否具有抑制作用的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，包括以下步骤： 

1）、目的蛋白的表达和纯化；

2）、建立过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡模型：

利用过氧化氢诱导家蚕细胞的凋亡，从而建立体外细胞凋亡模型；

3）、检测目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。

作为本发明的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法的改进：家蚕细胞凋亡模型的建立方法为：

将处于对数生长期的半贴壁家蚕培养细胞BmN按3×10³个/孔接种到96孔培养板，加入细胞全培养基后在细胞培养箱中于26~28℃（例如为27℃）培养至细胞铺满孔底（培养时间约为24h），弃去细胞全培养基后；用Hanks液洗，再分别加入100μmol/L、1mmol/L、5mmol/L和10mmol/L H₂O₂ 梯度处理2h、4h和6h，然后用Hanks液洗后，再分别加入细胞全培养基，继续于26~28℃（例如为27℃）培养22~26h（例如为24h）；

细胞全培养基为Sf-900：FBS=9：1的体积比。

作为本发明的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法的进一步改进：家蚕细胞凋亡模型的建立方法中，BmN细胞的最佳处理条件为：5mmol/L H₂O₂处理细胞，27℃培养4h。

作为本发明的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法的改进：步骤3）为通过ELISA法检测目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。

作为本发明的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法的进一步改进：步骤3）为：

将处于对数生长期的家蚕细胞BmN，按3×10³个/孔接种到96孔培养板中，加入细胞全培养基后在细胞培养箱中于26~28℃（例如为27℃）培养至细胞铺满孔底（培养时间约为24h）；再加入纯化的目的蛋白至目的蛋白终浓度为4~6μg/ml，对细胞进行预处理；继续于26~28℃（例如为27℃）培养22~26h（例如为24h）后，用Hanks液洗，再加入5mmol/L H₂O₂于26~28℃（例如为27℃）处理3.5~4.5h（例如为4h），接着用Hanks液洗，再加入含有浓度为5μg/ml目的蛋白的无血清细胞培养基，于26~28℃（例如为27℃）培养22~26h（例如为24h）；

然后分别检测细胞的活力、检测细胞的凋亡情况、检测细胞内8-isoprostane的浓度；

无血清细胞培养基为Sf-900。