[发明专利]检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法

权利要求书

1.检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是包括以下步骤：

1）、目的蛋白的表达和纯化；

2）、建立过氧化氢诱导的家蚕细胞凋亡模型：

利用过氧化氢诱导家蚕细胞的凋亡，从而建立体外细胞凋亡模型；

3）、检测目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。

2.根据权利要求1所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是：家蚕细胞凋亡模型的建立方法为：

将处于对数生长期的半贴壁家蚕培养细胞BmN按3×10³个/孔接种到96孔培养板，加入细胞全培养基后在细胞培养箱中于26~28℃培养至细胞铺满孔底，弃去细胞全培养基后；用Hanks液洗，再分别加入100μmol/L、1mmol/L、5mmol/L和10mmol/L H₂O₂ 梯度处理2h、4h和6h，然后用Hanks液洗后，再分别加入细胞全培养基，继续于26~28℃培养22~26h；

细胞全培养基为Sf-900：FBS=9：1的体积比。

3.根据权利要求2所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是：家蚕细胞凋亡模型的建立方法中，BmN细胞的处理条件为：5mmol/L H₂O₂处理细胞，27℃培养4h。

4.根据权利要求1、2或3所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是：

所述步骤3）为通过ELISA法检测目的蛋白对家蚕细胞凋亡的抑制作用。

5.根据权利要求4所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是所述步骤3）为：

将处于对数生长期的家蚕细胞BmN，按3×10³个/孔接种到96孔培养板中，加入细胞全培养基后在细胞培养箱中于26~28℃培养至细胞铺满孔底；再加入纯化的目的蛋白至目的蛋白终浓度为4~6μg/ml，对细胞进行预处理；继续于26~28℃培养22~26h后，用Hanks液洗，再加入5mmol/L H₂O₂于26~28℃处理3.5~4.5h，接着用Hanks液洗，再加入含有浓度为5μg/ml目的蛋白的无血清细胞培养基，于26~28℃培养22~26h；

然后分别检测细胞的活力、检测细胞的凋亡情况、检测细胞内8-isoprostane的浓度；

无血清细胞培养基为Sf-900。

6.根据权利要求5所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是：

利用Cell Proliferation ELISA试剂盒检测细胞的活力、Cell Death Detection ELISA试剂盒检测细胞的凋亡情况、8-isoprostane EIA kit检测细胞内8-isoprostane的浓度。

7.根据权利要求1~6任一所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是：利用蛋白免疫印迹法检测细胞色素c的释放。

8.根据权利要求7所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是：利用蛋白免疫印迹法检测细胞色素c的释放包括以下步骤：

将处于对数生长期的家蚕细胞BmN按1×10⁶个/皿接种于培养皿中，加入细胞全培养基后在细胞培养箱中于26~28℃培养至细胞铺满平皿；加入纯化的目的蛋白样品至目的蛋白终浓度为5μg/ml，对细胞进行预处理；继续于26~28℃培养22~26h后，用Hanks液洗，加入5mmol/L H₂O₂于26~28℃处理3.5~4.5h，接着用Hanks液洗，再加入含有浓度为5μg/ml的目的蛋白的无血清细胞培养基，于26~28℃继续培养22~26h；收集细胞，细胞用预冷的PBS清洗，加入裂解液；用细胞刮刮下细胞，收集细胞裂解液于离心管中离心，取上清，进行SDS-PAGE电泳，随后转移到PVDF膜；将膜置于含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液中封闭过夜，然后在含0.1% Tween-20的TBST缓冲液与纯化鼠抗细胞色素c单克隆抗体4℃孵育过夜；清洗后，用辣根过氧化物酶标记的二抗杂交，进行化学发光显色。

9.根据权利要求8所述的检测目的蛋白对昆虫细胞是否具有凋亡抑制作用的方法，其特征是：目的蛋白包括家蚕30Kc6蛋白、家蚕30K蛋白Slp、家蚕30K蛋白Lsp-t。