[发明专利]多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程、病毒学领域，具体涉及一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用技术领域。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)，是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的以侵害偶蹄动物为主的急性、热性、高度接触性人畜共患传染病，在国际上受到高度重视。该病毒属于小RNA病毒科FMDV属，有O型，A型，C型，SAT I型，SAT II型，SATIII型及Asia I型等7个血清型，70多个亚型，各型之间无交叉反应。流行病学调查和实验感染证明，有100多种动物可以感染。口蹄疫已被世界动物卫生组织(world organization of animal health，OIE)列为A类动物传染病之首。

(一)口蹄疫的发生和危害：

口蹄疫的发生早在五六百年前就已经有记载，在14-15世纪就有类似口蹄疫的牛病的描述。最早对于口蹄疫发生和流行的描述，应追溯到1546年，意大利学者Girolamo Fracastor较为详细地记录了1514年在意大利Friuli、Venice、Verona等地先后暴发口蹄疫的情况。

自意大利发生口蹄疫以来，口蹄疫在欧洲大陆流行了几百年，17-18世纪，口蹄疫在法国、意大利、德国、瑞士、奥地利等国经常大规模流行。英国也在1839年发生了口蹄疫。此后欧洲在1845-1894年之间均有口蹄疫的广泛流行。1991年保加利亚发生了一次规模较大的疫情。2001年口蹄疫在英国流行，同年9月欧洲各国声称口蹄疫在欧洲已经被消灭，然而在2007年8月英国由于实验室管道泄漏，再次出现口蹄疫。

根据联合国粮农组织(food and agriculture organization of the United Nation，FAO)和OIE发表的家畜卫生年鉴统计资料，1951-1953年亚洲每年都曾发生口蹄疫的大流行，1959年亚洲有16个国家或地区发生口蹄疫，1977年有13个，1979年多达30个，1982-1983年有27个，1984年有16个，1985年有10个，1987年又上升为22个，1989年仍有17个国家或地区流行口蹄疫。到了90年代后，亚洲口蹄疫疫情更为严峻。最严重的是1997年和2000年中国台湾和日本、韩国暴发大规模口蹄疫，损失严重。

中北美国家是世界上最早消灭口蹄疫的国家和地区，美国于1929年、加拿大于1952年、墨西哥于1954年宣布消灭口蹄疫。此前美国历史上口蹄疫曾发生了9次，墨西哥在1926年和1946年曾2次暴发口蹄疫，经过采取许多周密而有效的措施扑灭了疫情。南美国家口蹄疫的疫情较为严重，多年来造成很大的经济损失。不过经过南美各国在防制方面的努力，1981年智利宣布为无口蹄疫国家；到90年代，OIE曾将乌拉圭、阿根廷、巴拉圭、巴西划为“疫苗免疫的无口蹄疫国家或地区”。几年之后，口蹄疫又入侵阿根廷南部地区，只有智利一直保持着无口蹄疫国家的地位。

口蹄疫的发生和流行对当地的发展有着巨大的危害，以我国台湾地区1997年3月的疫情为例。这场口蹄疫风暴前后历时3个多月，共波及6147个养猪场，1011674头猪发病，184231头猪死亡，扑杀了600万头猪，直接经济损失高达15.52亿美元，相关行业的间接经济损失为62.08亿美元，国民经济总产值损失达104.76亿美元。

(二)RNAi技术在抗病毒上的应用：

由于病毒的入侵，很有可能造成宿主细胞的复制、代谢及其它正常生理功能受到影响，甚至使宿主细胞死亡，最终导致宿主的发病乃至死亡。目前抵抗和消除病毒感染给宿主带来的不良后果，主要依赖于抗病毒的药物和干扰素，然而病毒为了生存会在进化中不断形成新的耐药性，而且某些药物和干扰素对动物机体会产生很大的副作用。RNAi能阻断病毒感染途径，或抑制其作用过程中关键蛋白质的表达，是对抗病毒感染最有效的方式。因此，RNAi的出现给抗病毒研究提供了新思路，为病毒病治疗带来了新希望。

然而，科学家们至今已针对FMDV不同基因在细胞和动物等不同水平对RNAi抗FMDV效果进行了研究和探索。据报道，在长期使用siRNA抑制病毒复制的治疗过程中会使病毒基因变异而产生RNAi抗性，导致病毒逃逸。而为了解决这一问题，人们开始针对病毒基因组保守区或同时以不同基因序列作为靶基因。

发明内容