[发明专利]多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用

权利要求书

1.一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，其特征在于：所述表达载体为载体一或载体二，其中载体一为pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP；或载体二为LV-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。

2.根据权利要求1所述的一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，其特征在于：多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体中Cons1如序列1所示；Cons2如序列2所示；Cons3如序列3所示。

3.权利要求1或2所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法，包括下述步骤：

(1)、根据GenBank中口蹄疫病毒3B和3D基因的高保守区，化学合成3个shRNA串联的Cons1-Cons2-Cons3片段，连入pMD-18T载体，得到p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP载体；其中Cons1-Cons2-Cons3中在Cons1的5’端设有XbaI/SacI双酶切位点，在Cons1和Cons2之间设有ClaI/XhoI双酶切位点，在Cons2和Cons3之间设有BglII/MluI双酶切位点，在Cons3的3’端设有LoxP/NotI双酶切位点；

(2)、以水牛基因组为模板，以SEQ No.4/SEQ No.5为引物扩增出水牛7SK的启动子bu7SK；以水牛基因组为模板，以SEQ No.6/SEQ No.7为引物扩增出水牛U6的启动子buU6；以牛基因组为模板，以SEQ No.8/SEQ No.9为引物扩增出牛U6的启动子boU6；

(3)、对步骤(2)中得到的启动子片段和步骤(1)得到的载体分别进行双酶切后连接，依次将启动子bu7SK、启动子buU6和启动子boU6连入步骤(1)的p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP载体中，得到载体p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP；

(4)、用XbaI/NotI双酶切载体p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP，得到XbaI-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI；以慢病毒载体质粒pSicoR为载体骨架，用XbaI/NotI双酶切载体骨架后，用T4连接酶将XbaI-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI连接入XbaI/NotI双酶切后的pSicoR质粒中，得到多个抗口蹄疫shPRNA串联表达载体一pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP；

(5)、将载体一与慢病毒包装质粒pNRF和pVsvg在293T细胞中共转染，得到载体二LV-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。

4.根据权利要求3所述多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)具体方法如下：

(a)、首先用内切酶XbaI/SacI将p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP切开，将bu7SK启动子用T4连接酶连接至Cons1的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP；

(b)、其次用内切酶ClaI/XhoI将p18T-bu7SK-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP切开，将buU6启动子用T4连接酶连接至Cons2的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-Cons3-LoxP；

(c)、最后用内切酶MluI/BglII将p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-Cons3-LoxP切开，将boU6启动子用T4连接酶连接至Cons3的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP。

5.由权利要求1或2所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体在检测由该载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制方面的应用或者在构建转基因小鼠方面的应用。