[发明专利]大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录等温扩增检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物监测领域，涉及大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录等温扩增检测方法。

背景技术

大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）是一种在世界很多国家广泛分布并极具破坏性的一种的病毒，每年都会给很多国家带来巨大的农业经济损失。由于该病害在世界范围内广泛分布并普遍发生，导致大豆严重减产和种质衰退，所以发展SMV病毒病害的快速检测方法对于该病害的诊断及准确把握该病害的流行规律和提出有效防治措施非常重要。目前大豆花叶病毒病的检测包括生物学鉴定、电镜鉴定、酶联免疫反应（ELISA）和逆转录聚合酶链式扩增反应（RT-PCR）。

环介导逆转录等温扩增（Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification,RT-LAMP）是近几年新发展出的一种新型的基因扩增技术，它的优点包括扩增时间短、灵敏度高以及不需要昂贵的循环扩增仪器，它已被广泛应用于多种人类流行性病毒的检测。这种技术也逐渐被应用于植物病毒的检测，但是RT-LAMP检测目前还没有被用于SMV的快速检测上。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足之处，提供一种大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录等温扩增检测方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种用于大豆花叶病毒检测的一步法环介导逆转录等温扩增检测的引物组，正向外引物F3的序列为SEQ ID NO.1，反向外引物B3的序列为：SEQ ID NO.2，正向内引物FIP的序列为：SEQ ID NO.3，反向内引物BIP的序列为：SEQ ID NO.4。

所述的引物组在制备一步法环介导逆转录等温扩增检测大豆花叶病毒的试剂盒中的应用。

一种用于大豆花叶病毒检测的一步法环介导逆转录等温扩增检测的试剂盒，包含本发明所述的引物组。

所述的试剂盒包含以下RT-LAMP反应液：

*括号中的浓度表示相应物质在反应体系中的终浓度

大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录等温扩增检测方法，使用本发明所述的引物组进行RT-LAMP反应，将反应产物于1%TBE琼脂凝胶中电泳或用荧光染料SYBR Green I对扩增产物的可视化；反应呈阳性，表明存在大豆花叶病毒；反应呈阴性的表示待测样品不含大豆花叶病毒。所述的反应呈阳性是指电泳结果出现典型的LAMP条带，或扩增产物在荧光染料SYBRGreen I存在下由橙色变为绿色；所述的反应呈阴性是指电泳结果未出现典型的LAMP条带，或扩增产物为橙色。

所述的大豆花叶病毒的一步法环介导逆转录等温扩增检测方法，具体包含如下步骤：

（1）对待检样品进行RNA粗提取得RNA粗提取液：取100mg叶片，用400μL的0.5MNaOH中快速研磨，低速离心后快速取10μL上清于490μL的100mM Tris–HCl(pH8)溶液中，混匀待用；

（2）以提取的RNA为模板，以所述的特异性引物F3、B3、FIP及BIP为引物配制RT-LAMP反应溶液，反应液组成如下：

*括号中的浓度表示相应物质在反应体系中的终浓度

（3）将配好的RT-LAMP反应溶液于65℃的反应温度中进行反应，反应时间为60min，然后80℃，5min；

（4）对反应产物进行结果分析：将反应产物于1%TBE琼脂凝胶中电泳或用荧光染料SYBRGreen I对扩增产物的可视化，反应呈阳性，表明存在大豆花叶病毒；反应呈阴性的表示待测样品不含大豆花叶病毒。

有益效果：

本发明首次公开了大豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。本发明选取SMV CP保守区序列(GenBank:HM590055.1)作为靶序列，筛选出特异性引物组，保证了RT-LAMP检测中对SMV的特异性，以及对不同株系SMV检测的通用性。

本发明通过将RNA快速粗提取方法与SMV RT-LAMP检测相结合，以快速粗提取的待测样品总RNA作RT-LAMP的反应模板，节省了一般RT-LAMP采用常规RNA抽提方法所花费的冗余时间，简化了操作过程，加快了SMV检查速度，实现对大豆花叶病毒的一步检测。

附图说明