[发明专利]一种盐酸柔红霉素菌种及其高产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程制药技术领域，特别涉及一种盐酸柔红霉素菌种及其高产方法。

背景技术

蒽环类抗生素（Anthracyclines）是一类重要的抗肿瘤药物，它们均由蒽环酮的发色团通过糖苷键和一种或几种不同的糖连接而成。大多数蒽环类的抗生素具有很强的骨髓抑制和心脏毒性而不能应用于临床，只有柔红霉素-阿霉素型蒽环类抗生素成为临床上最有应用价值的抗肿瘤药物，包括柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、洋红霉素等。柔红霉素在临床上主要用以治疗急性白血病，对急性淋巴细胞性白血病和急性粒细胞性白血病，柔红霉素可作为首选药物，柔红霉素还可以治疗淋巴肉瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤等。

柔红霉素（Daunorubicin，DNR），又称道诺霉素（Daunomycin），是某些链霉菌的次级代谢产物，例如波赛链霉菌（Streptomyces peucetius），天蓝淡红链霉菌（S.coeruleorubidus），灰色链霉菌，链霉菌C5等等。目前工业上采用微生物发酵法生产柔红霉素，国外主要使用的菌种是波赛链霉菌；国内主要使用的是正定变种HB1482。

由于柔红霉素是具有细胞毒性的抗肿瘤抗生素，初始的柔红霉素产生菌的发酵单位一般较低，导致生产成本很高，并不能立即作为工业化生产用菌。对柔红霉素产生菌进行包括分子育种、常规诱变育种在内的选育工作，是提高柔红霉素发酵产量、降低生产成本的最有效的途径之一。

为了提高柔红霉素产生菌的发酵产量，国内外研究者做了大量研究工作。如采用柔红霉素筛选耐受菌株以提高菌株的蒽环类抗生素的产抗能力（斯图兹 曼·恩格沃，《链霉菌的次生代谢调控及柔红霉素的产生》《细菌学杂志》，刊号：1992,174，页数：144-154）携带dnrl基因的高拷贝表达质粒转化野生型柔红霉素产生菌，提高转化子的柔红霉素产抗水平；以SIPI1482为出发菌株，采用紫外诱变和自身耐药等复合处理，获得高产突变株SIPI-89068，其发酵产柔红霉素产量水平提高了3-4倍（李莉，许文思，《柔红霉素产生菌SIPI89068的选育及发酵》，《中国抗生素》杂志，刊号：1993,18(4):页数：306-307）等。

由于抗肿瘤抗生素产生菌的菌种选育有相当大的难度，通过上述工作，不同菌种的柔红霉素发酵产量虽然有了不同程度的提高，但与其他种类的抗生素发酵水平相比，仍然有相当大的差距。

近年来随着分子生物学的快速发展，在单个基因水平、基因组水平对柔红霉素的生物合成途径等有了越来越多的认识，使组合利用新技术及传统诱变手段对柔红霉素产生菌进行菌种选育，进而获得高产柔红霉素菌种成为可能。

发明内容

针对现有柔红霉素发酵产量不高的上述缺陷和问题，本发明实施例的目的是提供一种盐酸柔红霉素菌种及其高产方法，通过紫外诱变，离子注入诱变，结合基因组改组，获得高产柔红霉素的菌种。

为了达到上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种盐酸柔红霉素菌种的高产方法，包括以下步骤：

Q1：原生质体的制备，包括以下分步骤:

Q11：取培养菌丝体，以5000-7000转/分钟的速率，离心5-8分钟后得沉淀，加生理盐水进行洗涤，再次离心后弃澄清部分，并以漩涡振荡的方式分散菌丝体；

Q12：在Q11步骤中处理后的悬浮菌丝体中加入生理盐水，再加入溶菌酶溶液，用移液枪吹吸5次混匀后，于30°水浴中进行酶解，每隔10分钟， 用移液器吹吸3次，90分钟后终止酶解;

Q13：以2000转/分钟的速率，离心5分钟上述Q12步骤结束后的处理液，使残留的菌丝断片沉于管底，取上部澄清部分，即为原生质体悬浮液，转移到另一灭菌离心管中备用，并以3000转/分钟的速率，离心10分钟该原生质体悬浮液，温和地去除溶菌酶液，沉淀出原生质体；

Q14：取Q13步骤中沉淀出原生质体部分，轻轻震荡离心管，使原生质体分散开成原生质体悬浮液，加生理盐水进行稀释并对原生质体计数，使原生质体的浓度为100个/毫升；

Q2：原生质体的再生，包括以下分步骤：

Q21：取0.5ml-1ml Q14步骤中得到的原生质体悬液，与25ml-50ml软琼脂混合均匀，倾倒于R2YE平板上层的培养基中；

Q22：另取一R2YE平板，盖住Q21步骤中的R2YE平板，将双层培养基平板于28°倒置培养；

Q3：原生质体的紫外诱变，包括以下分步骤：