[发明专利]一种盐酸柔红霉素菌种及其高产方法

权利要求书

1.一种盐酸柔红霉素菌种的高产方法，其特征在于，包括以下步骤：

Q1：原生质体的制备，包括以下分步骤:

Q11：取培养菌丝体，以5000-7000转/分钟的速率，离心5-8分钟后得沉淀，加生理盐水进行洗涤，再次离心后弃澄清部分，并以漩涡振荡的方式分散菌丝体；

Q12：在Q11步骤中处理后的悬浮菌丝体中加入生理盐水，再加入溶菌酶溶液，用移液枪吹吸5次混匀后，于30°水浴中进行酶解，每隔10分钟，用移液器吹吸3次，90分钟后终止酶解;

Q13：以2000转/分钟的速率，离心5分钟上述Q12步骤结束后的处理液，使残留的菌丝断片沉于管底，取上部澄清部分，即为原生质体悬浮液，转移到另一灭菌离心管中备用，并以3000转/分钟的速率，离心10分钟该原生质体悬浮液，温和地去除溶菌酶液，沉淀出原生质体；

Q14：取Q13步骤中沉淀出原生质体部分，轻轻震荡离心管，使原生质体分散开成原生质体悬浮液，加生理盐水进行稀释并对原生质体计数，使原生质体的浓度为100个/毫升；

Q2：原生质体的再生，包括以下分步骤：

Q21：取0.5ml-1ml Q14步骤中得到的原生质体悬液，与25ml-50ml软琼脂混合均匀，倾倒于R2YE平板上层的培养基中；

Q22：另取一R2YE平板，盖住Q21步骤中的R2YE平板，将双层培养基平板于28°倒置培养；

Q3：原生质体的紫外诱变，包括以下分步骤：

Q31：将按照Q14步骤制备好、稀释好浓度的原生质体悬液进行紫外诱变：

Q311：紫外线照射强度为10-25W,200-350nm,光源距离保持30cm不变，一次性持续紫外照射时间分别为30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟；

Q312：保持紫外线照射强度15W，254nm，照射距离分别设置为10cm、20cm、30cm、40cm、50cm，每个距离的照射时间均为3分钟；

Q32:完成后，按照Q2步骤，28°的培养环境下，避光培养5天-10天时间；

Q4:离子注入诱变处理:将按照Q14步骤制备好的原生质体悬液按照下列步骤进行离子注入诱变处理：

Q41：将孢子悬浮液均匀涂布于玻璃片上，自然风干表面水分；

Q42：以N+作为辐射致变剂，辐射室的真空度:10^-3Pa，离子能量:65kev，辐射处理的剂量率1015N+/秒，总辐射剂量为1*1015N+/cm²；

Q43：处理后，用生理盐水将玻璃片上的孢子洗脱，对洗脱的孢子液进行梯度稀释，分别取稀释10倍-50倍数的孢子液均匀地涂布在高氏一号培养基筛选平皿上，30℃培养10天；

Q5：分别以Q3步骤处理完成和Q4步骤处理培养长出的菌落作为具有不同遗传背景的亲本，进行下列基因组改组处理：

Q51：分别对上述不同遗传背景的亲本进行原生质体制备，即重复步骤1的方法步骤，然后将处理后的两部分原生质体混合；

Q52：以3000转/分钟的速率，在离心机中，离心上述混合液10分钟，弃上部澄清液；

Q53：将上一步骤得到的沉淀中加入生理盐水，静置产生分层后得到的沉淀物质，再次以3000转/分钟的速率，离心10分钟，弃去上部澄清液；

Q54：于得到的沉淀中缓慢加入500μml溶解在生理盐水中的、浓度为65%的PEG溶液，室温静置1分钟；

Q55：加入500μml生理盐水，并以3000转/分钟的速率，离心10分钟，弃去上部澄清液；

Q56：重复一次Q55；

Q57：将上一步骤得到的沉淀中加入生理盐水，再与4毫升软琼脂混合，迅速倾倒于R2YE平板上，在28°中进行培养；

Q6：杂合再生子代菌丝体的培养：

将Q5步骤中于R2YE培养基中长出的菌落，用接种铲刮下，接种于YEME培养基中，28°的培养环境中培养三天，再按10%的接种量接种于含0.5%甘氨酸的YEME培养基中，继续在28°的培养环境中培养24小时；

Q7：杂合子代原生质体制备及原生质体融合：

Q71：将步骤Q6完成的杂合子代菌丝体，重复一遍步骤Q1，完成制备新的原生质体；

Q72：按步骤Q57的方法进行原生质体融合，即在上述原生质体沉淀中加入PEG溶液，进行原生质体融合，并与软琼脂混合，倾注于R2YE平板上,在28°的培养环境中长出的菌落即为第二轮融合后的再生群体;

Q8：子代原生质体多轮融合与再生:按照上述Q1-Q7进行后继子代的多轮反复融合与再生。