[发明专利]一种丝氨酸蛋白酶编码基因和重组酶及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种丝氨酸蛋白酶编码基因和重组酶及应用。

背景技术

丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，其主要作用是断裂大分子蛋白质中的肽键。核心结构由N结构域和C结构域构成。丝氨酸蛋白酶的催化位点和重要功能位点存在于这两个结构域间。丝氨酸蛋白酶的功能具有特异性和复杂性，所催化的底物特异性强。蛋白质在功能进化的过程中不仅要适应物种进化的外在环境，同时也要适应内在分化所产生的体内环境。在这过程中，丝氨酸蛋白酶也为适应一些新功能而产生了分化。目前，一些丝氨酸蛋白酶的结构已经被测定，其催化机制、活性部位也有研究。相关研究为利用蛋白质工程改造丝氨酸蛋白酶的研究提供了基础。有研究人员通过改变活性部位残基研究对催化性能的影响，比如Asp102被Asn取代，验证了Asp102在催化机制中的作用；

在哺乳动物体内，丝氨酸蛋白酶在消化、凝血和补体系统方面发挥着重要作用。丝氨酸蛋白酶在心血管疾病医治方面有广泛的应用；最近发现的一种分布于心脏的特异性II型跨膜丝氨酸蛋白酶，能将A型利钠肽前体(pro ANP)和B型利钠肽前体(pro-BNP)转化为ANP和BNP。研究发现，植物细胞中的丝氨酸蛋白酶在植物器官衰老过程中发挥着作用，多种植物的叶和花的衰老过程都与丝氨酸蛋白酶基因表达相关联；真菌基础上的丝氨酸蛋白酶研究也有应用，通过芯片技术结合免疫组化方法，不仅能够检测多种新生隐球菌菌株细胞中丝氨酸蛋白酶的表达分布，还可以横向对比丝氨酸蛋白酶在新生隐球菌致病过程中的作用。

新型丝氨酸蛋白酶的研究与开发是获得特异性丝氨酸蛋白酶的基础。目前对细菌中新型丝氨酸蛋白酶的开发较少，在Pantoea ananatis中的研究未有报道。随着分子生物学、基因工程的迅猛发展，研究人员开始应用基因工程技术构建新型丝氨酸蛋白酶降解菌株、开发新型丝氨酸蛋白酶，这将促进新型丝氨酸蛋白酶产品的开发与应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型丝氨酸蛋白酶编码基因ds的基因序列及其氨基酸序列。采用PCR方法克隆获得丝氨酸蛋白酶编码基因。

本发明的一种新型丝氨酸蛋白酶编码基因ds，所述丝氨酸蛋白酶的基因序列为SEQ ID NO.1。

所述丝氨酸蛋白酶的基因ds是一个完整的开放阅读框（ORF），该开放阅读框以启始密码子ATG开始，以终止密码子TGA结束，共包括1062bp。

本发明的一种新型丝氨酸蛋白酶，所述丝氨酸蛋白酶的重组酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

所述内切丝氨酸蛋白酶共352个氨基酸序列。

本发明的另一目的，在于提供一种新型重组丝氨酸蛋白酶DS。该重组酶的蛋白酶活性高，达到22.17U/mL。

所述重组丝氨酸蛋白酶DS的制备方法，包括如下步骤：

（1）重组菌株的构建：

以F:GAGCATATGTTTCTTAAACTCTTGCGT和R:ATCTCGAGCTACTGACTGCTGTCC为PCR反应的引物；以PCR方法从菌株Pantoea ananatis P5（CGMCC NO.5356）基因组中克隆获得丝氨酸蛋白酶编码基因ds全长，以两种限制性内酶NdeI和XhoI将基因ds进行双酶切，并连接到原核表达载体pET中，构建成质粒pETDS，转化E.coli BL21感受态细胞，利用NdeI和XhoI双酶切，筛选获得重组菌株，构建成重组丝氨酸蛋白酶DS的表达菌株DS/BL21(DE3)；

（2）重组菌株的培养和重组丝氨酸蛋白酶的获得：

将重组菌株DS/BL21(DE3)接种到50mL LB（含30μg/mL卡那霉素）液体培养基中，在37℃震荡培养；待OD₆₀₀为0.5时，加入0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导4h终止培养；将培养液在液氮中速冻，放冰水混合物里融化，使用超声波破碎细胞，10000r/min离心5min，取上清即为重组内切丝氨酸蛋白酶的酶液。

本发明的再一目的，在于提供上述新型重组丝氨酸蛋白酶DS的应用。所述丝氨酸蛋白酶能够应用于蛋白质的降解。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

（1）根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶的分子量、等电点和酶学特性等特性与已知蛋白的差异判断，该重组丝氨酸蛋白酶DS的基因是一种新型丝氨酸蛋白酶基因。这是首次从Pantoea ananatis菌株中开发出重组丝氨酸蛋白酶基因。