[发明专利]一种表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌及其构建方法和应用。 

背景技术

猪γ-干扰素(porcine interferon gamma，PoIFN-γ)也称猪II型干扰素，是一类由活化的T淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞等分泌的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤、激活淋巴细胞和免疫调节等功能。实际应用中，将猪干扰素作为疫苗佐剂，与治疗不同疾病的疫苗联合使用，研制出免疫效果更好的新型疫苗，对猪病防治具有积极的影响。 

目前猪干扰素的批量生产主要有细胞诱导培养法和以毕赤酵母、大肠杆菌为表达系统的基因重组法。前一种方法以动物细胞为原料，生产工艺复杂，成本高，且产品有携带外源病毒和其他病原微生物的危险。以毕赤酵母为表达系统的基因重组法虽较前一种先进，生产成本大大降低，但其工艺还是相对较复杂且表达量有限。而以大肠杆菌为表达系统的基因重组法，虽能提高其表达量，但产物为无活性的包涵体，需经繁琐低效、代价昂贵的复性过程才能获得生物学功能。因此，如何获得高表达量的活性猪γ-干扰素成为近年来学者们广为研究的热点。 

本发明克服了上述现有技术制备猪γ-干扰素表达量低、产物为无活性包涵体、制备工艺复杂繁琐等缺陷，提出了一种表达可溶性猪γ-干扰素的基因工程菌及其构建方法，以及利用该基因工程菌进行猪γ-干扰素的高效制备方法；通过采用自诱导培养基发酵表达猪γ-干扰素，省去了监测菌体密度和添加IPTG诱导剂等步骤，使操作简洁易行，同时避免了IPTG对菌体的毒害作用。利用本发明方法制备猪γ-干扰素，成本低、易操作、产量高且活性好。 

发明内容

本发明提出一种表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌，所述基因工程菌是同时携带重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ和质粒pTf16-P_araB-tig的大肠杆菌BL21(DE3)。其中，所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ中的PoIFN-γ基因序列是SEQ ID NO.4；所述质粒pTf16-P_araB-tig可表达分子伴侣tig。 

其中，所述PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)的5′端为SEQ ID NO.2(含肠激酶和KpnI酶切位点)，3′端为SEQ ID NO.3(含终止密码子和BamHI酶切位点)，中间为经优化的猪 γ-干扰素成熟肽基因(SEQ ID NO.1)。 

本发明还提出了所述基因工程菌的构建方法，其步骤为：将所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ和质粒pTf16-P_araB-tig分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述基因工程菌。 

其中，所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ的构建方法为：首先人工合成所述PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)，用KpnI/BamHI对所述PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)和质粒pET-32a(+)进行双酶切，连接、转化大肠杆菌DH5α，再挑取重组子并提取得到所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ。所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ经测序鉴定，证实其含有所述PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)。 

本发明还提供一种应用所述基因工程菌制备可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的方法，其步骤为：将所述表达可溶性猪γ-干扰素的基因工程菌于LB液体培养基中进行培养后，转接入自诱导培养基继续培养，然后离心收集菌体；重悬所述菌体，搅拌过夜后，将其超声破碎并离心收集上清，经镍离子亲和层析并脱盐、浓缩得到纯化的猪γ-干扰素融合蛋白，将其酶解后再次经镍离子亲和层析并脱盐、浓缩，得到所述猪γ-干扰素。 

其中，所述自诱导培养基的配方为：甘油0.1-2％v/v、胰蛋白胨0.1-2％w/v，酵母提取物0.1-2％w/v，乳糖0.1-2％w/v，葡萄糖0.01-0.2％w/v，NaCl0.1-2％w/v，Na₂HPO₄5-100mM，KH₂PO₄5-100mM，(NH₄)₂SO₄5-100mM，MgSO₄1-20mM。 

其中，所述菌体的重悬使用破菌缓冲液，其配方为：Tris10-100mM、溶菌酶0.01-0.2％w/v、TritonX-1000.1-1％v/v。