[发明专利]一种制备艾卡拉肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备多肽的方法，具体涉及一种制备Ecallantide（艾卡拉肽）的方法。

背景技术

Ecallantide（后文称为“艾卡拉肽”）为一种长链多肽，其由60个氨基酸顺序构成，并含有三对二硫键。艾卡拉肽的序列如SEQ ID NO.：1所示:

美国食品药品监督管理局于2009年12月1日批准Oyax公司新药艾卡拉肽（商品名：Kalbitor）用于遗传性血管水肿（HAE）突发或致命性积液的治疗。艾卡拉肽是在美国上市的第二种治疗HAE发作的药物。该药为皮下注射剂，适用于16岁及16岁以上有HAE发作史的患者

但是，在2012年6月14日，Dyax公司发布了艾卡拉肽用于治疗血管紧张素转化酶（ACE）抑制物所致血管神经性水肿II期临床试验的中期分析结果。基于其中期结果不是非常理想，Dyax公司决定中断此药的临床研究，转向基于艾卡拉肽的进一步深度研究和开发。

虽然，艾卡拉肽在随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验中表现没有预期的良好，但是其为治疗遗传性血管水肿提供了一个有前景的方向，可以预见，以后在艾卡拉肽的基础上将会衍生出许多新的药品用于治疗遗传性血管水肿，因此，需要建立一种制备艾卡拉肽的方法以满足不断增加的科研需要。

由于艾卡拉肽的肽序较长并且其中含有三对二硫键，在合成过程中肽链容易发生卷曲，反应位点不易裸露，故鲜有化学合成的方法报道。目前，艾卡拉肽相关的专利主要集中于药理活性和治疗方面，例如WO2007/106746A2、US2007/0213275A1和EP20070758271中记载的。迄今为止，尚没有对艾卡拉肽进行化学全合成的报道。

发明内容

现有技术的固相多肽合成中，常规的逐个偶联方法在进行长肽的偶联时，往往随着偶联氨基酸的个数增多而易使肽链发生折叠卷曲，反应位点裸露不足，导致偶联效果越来越差。此外，由于艾卡拉肽的肽链中包含三对二硫键，常规方法由于采用了多对二硫键逐对的进行定向氧化方法，使用了多种侧链脱除和氧化试剂，每一个步骤必然带来杂质的增多，因此不利于得到高纯度，高收率的产物，也不利于工艺的放大。

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种艾卡拉肽的全合成方法，具体提供一种艾卡拉肽的固相-液相全合成方法，其包括下述步骤：

（1）以2-CTC树脂为载体分别合成以下肽树脂：1、Fmoc-Gly-CTC树脂；2、Fmoc-Arg(Pbf)-CTC树脂；3、Fmoc-Pro-CTC树脂；4、Fmoc-Ala-CTC树脂；然后采用固相多肽合成方法分别将肽树脂1、2、3、1和4从C端到N端逐一偶联上带有Fmoc保护基的氨基酸，再经裂解液裂解得到相应的多肽片断A、B、C、D和E，其中

多肽片段A为

Fmoc-Gln(Trt)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Tyr(tBu)-Gly-OH；

多肽片段B为

Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Phe-Phe-Asn(Trt)-Ile-Phe-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-OH；

多肽片段C为

Fmoc-Pro-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Ala-Ala-His(Trt)-Pro-OH；

多肽片段D为

Fmoc-Phe-Lys(Boc)-Ala-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Gly-OH；

多肽片段E为

Fmoc-Glu(OtBu)-Ala-Met-His(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Cys(Acm)-Ala-OH；