[发明专利]酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），俗称“蓝耳病”是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的，该病毒是巢状病毒目动脉炎病毒科的一个成员，同属的病毒还有马动脉炎病毒，鼠乳酸脱氢酶酶病毒和猴出血热病毒。该病主要引起猪的繁殖与呼吸症状，表现为间质性肺炎和母猪流产木乃伊胎等，每年对全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。2007年在中国爆发了一场高热病，该病迅速在全国范围扩散，超过200万头猪被感染，40万头猪死亡，该病最后证实是由一种高致病性的蓝耳病毒引起的。PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞，现在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干扰素应答，体液免疫不能及时产生有效的中和抗体，而且会形成抗体依赖的病毒增强效应，最终导致免疫抑制和持续感染，由于该病毒的突变率极高，传统疫苗方法也不能有效控制该病，很多研究都致力于寻找RNAi，干扰素等新的方法来针对该病毒，用于弥补传统方法的不足。

由于不同的猪品种和个体的遗传背景差异，对蓝耳病的抗性也不同，研究表明在临床症状和生理生化指标上，通城猪、梅山猪等国内猪品种相较于国外长白猪、大白猪等感染高致病性PRRSV后有较强的抗性。通过高通量测序的方法，对感染PRRSV前后长白猪和通城猪的组织做差异基因表达分析，某些免疫相关的基因表达量在感染前后四个品种间有显著的差异。另外，存在一些品种间的SNP位点，这些基因在宿主的免疫应答中起到了很重要的作用，而且这些SNP位于基因的外显子中，通过找出不同品种间PRRSV感染造成的基因表达差异，不仅可以研究PRRSV的感染机制，还可以找出抗性或易感相关的基因，通过对品种间的SNP进行比较分析，从而筛选出抗性较强的猪。

发明内容

本发明的目的是提供酪氨酸蛋白激酶JAK2基因中与猪抗蓝耳病相关的SNP标记及其应用。

酪氨酸蛋白激酶JAK2参与细胞生长、发育、分化以及组蛋白修饰等许多重要的生理过程，在天然免疫和和获得性免疫的信号调节通路中起到了重要的作用，它可以和II类型受体，如IFN-α、IFN-β、细胞白介素的受体结合，在信号转到的过程中发挥重要作用，当干扰素等细胞因子结合到受体上时，JAK随即结合到受体的细胞质末端，随后磷酸化SATA形成同源或异源二聚体，进入到细胞核里，激活相关基因的转录。本发明人首次发现在两个不同抗性的猪品种：长白猪（易感猪）、通城猪（抗病猪）之间的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因外显子中存在四个品种间SNP位点，用常规分子生物学方法检测这四个位点的碱基类型，可以作为一种检测抗病和易感猪的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种与猪抗蓝耳病相关的SNP标记，其位于猪的酪氨酸蛋白激酶JAK2基因上，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，该序列的81bp、115bp、151bp和264bp四处碱基分别为T、A、G和A的待测猪为易感蓝耳病猪品种，而这四处碱基分别为C、G、A和T的待测猪为抗蓝耳病猪品种。

本发明还提供用于检测与猪抗蓝耳病相关的SNP标记的引物对，其包括上游引物F：5’-AAGCATGATGAGCCAGCTTT-3’和下游引物R：5'-CCACTTCCCCAGTGTTGTCT-3'。

本发明还提供与猪抗蓝耳病相关的SNP标记在鉴定抗蓝耳病猪品种中的应用，其包括步骤：1）提取待测猪样品组织中的总RNA，反转录成cDNA；2）以步骤1）中的cDNA为模板，F和R为引物，进行RT-PCR反应；3）分析PCR产物，如果扩增产物序列中81bp、115bp、151bp和264bp四处的碱基分别为C、G、A和T，则待测猪为抗蓝耳病猪品种。

反转录PCR的步骤为：

i）打开RNA二级结构

在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：

ii）反转录PCR

向上述离心管中加入：

反转录PCR的反应条件为：42℃，60min。

常规PCR使用的扩增体系以15μl计为：

常规PCR的反应条件为：：95℃ 5min；以95℃ 30s，50℃-70℃，30s-2min；72℃ 30s-2min做35个循环；72℃ 10min，于4℃保温。