[发明专利]猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒，属于兽用生物制品制造领域。

背景技术

猪瘟（classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，HCL在世界养猪国家有不同程度流行，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病（王琴.猪瘟病毒流行病学、病原致病特性及猪瘟综合防制研究.中国农业科技导报，2006，8(5)：13-18）。HCLV是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的一个成员。病毒基因组为单股正链RNA，全长12.3kb，包括一个大的ORF，编码由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，此多聚蛋白又进一步被加工成4个成熟的结构蛋白（C、E0、E1、E2）和7个非结构蛋白(Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)（Rumenapf T,Meyers G,Stark R,et al.Molecular characterization of hog cholera virus.Arch virol Suppl.1991,3:7-18；Van Ri jn P A,Van Gennip H G P,Moormann R J M.An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on envelope glycoprotein E2 of classicalswine fever(CSFV).Vaccine,1999,17:433-440）。

1955年我国研制出用经人工诱变获得的猪瘟病毒兔化弱毒（HCLV）株（又称C株）制备的猪瘟活疫苗，该疫苗具有高度安全性和优良的免疫原性至今仍在世界范围内被广泛应用（仇华吉，童光志，沈荣显.猪瘟兔化弱毒疫苗-半个世纪的回顾.中国农业科学，2005，38(8)：1675-1685），该疫苗对控制猪瘟起到了重要作用，在预防猪瘟方面做出了巨大贡献。因此，疫苗合格与否十分重要，因此疫苗的质量也变得至关重要。检测疫苗质量的关键指标就是疫苗的效价，因此对疫苗的准确完全定量显得极为重要。HCLV可以在PK-15、ST等多种细胞上生长，但是均不产生细胞病变（CPE）。因此，迄今为止对猪瘟弱毒疫苗中的病毒含量还没有一个稳定的重复性好定量方法。在过去60多年中，兔体定型热反应法一直是对其疫苗效价测定的经典方法。但是该方法需要时间太长，并且实验中有很多不可控制的因素影响结果的可靠性和稳定性。特别是兔子对疫苗病毒热反应的个体差异性会显著影响检测结果。。但是至今却不能为该疫苗完全定量，近年来国内外建立了数种检测方法，特别是荧光定量RT-PCR技术应用于检测CSFV的比较多（温国元，万超.应用荧光定量PCR技术快速定量检测猪瘟病毒.武汉大学学报：理学版，2004，50(6)：746-750；Hoffmann B,Beer M,Schelp C,et al.Validation of a real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever.J Virol Methods,2005,130(1-2):36-44；高博，杨晓农，子掌辉，等.快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立应用.西南民族大学学报：自然科学版，2009，35(1)：92-97；朱中武，黄萍，鲁杏华，等.实时荧光RT-PCR快速检测猪源性食品中猪瘟病毒的研究.中国预防兽医学报，2009，31(8)：627-630），但这些方法都不是完全定量的方法。目前建立的Taq-Man实时荧光定量RT-PCR方法可以对疫苗中的病毒核酸做定量，并且具有很高的灵敏度。但是该方法不能将疫苗中的有复制能力的活病毒粒子与死亡的病毒粒子区别开来，不能区别具有感染力和不具有感染力的病毒，还是没有实现对疫苗所必须的活病毒的定量。