[发明专利]一种可实时监测的固相指数富集的配体系统进化技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种改进的指数富集的配体系统进化技术，主要改进其筛选过程的实时监测和筛选靶标的固相化方法，主要用于高特异性核酸适配体的快速筛选。

背景技术

指数富集的配体系统进化技术（SELEX）是指寡核苷酸依靠自身对相应靶物质的高亲和力和高特异性，在一含有极多随机序列的寡核苷酸文库中，通过多次的选择富集，来获取所需要的特定结构和功能适配子的过程。这一技术适用于富集任何特殊需要的生命小分子物质。SELEX技术的发展基于上世纪70年代和80年代的单克隆、核酶、PCR技术。目前这一技术已经广泛应用于基因调控与信号传导、蛋白质功能、核酸、肿瘤学、病毒学及食品安全检测等众多领域。

但目前SELEX方法仍存在筛选过程较长，因为特定核苷酸在文库中的含量较低，前期筛选存在盲筛，最终筛选成功率较低等弊端；而且目前筛选仍要借助的毛细管电流等昂贵仪器设备，限制了这一技术的广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题：克服现有技术的缺陷，提供一种快速、可实时监测、不依赖昂贵设备的SELEX方法。

本发明的技术方案：

构建长度为60-100 nt的随机ssDNA文库，两端为固定序列，中间20-60个核苷酸为随机序列，库容量至少为10¹⁴。设计随机ssDNA文库：5'- CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT -（20-60 nt） -AGTATCGCT AATCAGGCGGAT -3'。上游引物设计：5'-CCCCTGCA GGTGATTTTGCTCAAGT-3'，下游5'端标记生物素:5'-生物素-ATCCGCCTGATTAGCGATACT-3’。以ssDNA文库为模板，进行PCR扩增得到3'端带有生物素的dsDNA文库，经生物素-链霉素磁珠分离ssDNA。

将分离的文库与固相结合于聚苯乙烯微量反应板的靶标在适当温度条件下反应，反应一定时间后，用冲洗缓冲液洗去未结合的ssDNA；加入适量链霉素-荧光素，在酶标仪中检测其荧光强度，初步判定筛选效率；在PCR体系中，下游引物的5'端标记有生物素。加洗脱缓冲液于80℃作用10min，经酚-氯仿抽提、乙醇溶液，将ssDNA溶解于20μl TE缓冲液中，将ssDNA用标记生物素的引物经PCR扩增成一端带生物素的dsDNA。经生物素-链霉素磁珠分离ssDNA，用于下一轮筛选的ssDNA文库。

本发明的积极有益效果：

１. 本发明的SELEX方法具有下列优点：

（1）可实时监测：利用链霉素偶联荧光物质的高灵敏性，可在筛选前期对初步筛选效果进行判定，以最大限度加快SELEX筛选进程；

（2）设备简单：固相SELEX方法仅需要可检测荧光的酶标仪，可大大减少对毛细管电泳等大型设备的依赖，推动SELEX方法的普及应用。

２. 本发明的检测方法可广泛用于靶标的核酸适配体筛选，具体包括：酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞粘附因子、植物凝集素、完整的病毒颗粒、病原菌等；也包括有机染料、金属离子、药物、氨基酸等小分子物质的筛选。

附图说明

图1：本发明的可实时监测的固相SELEX方法示意图。

图2：本发明用于重金属筛选核酸适配体的过程示意图。

具体实施方式

本发明的检测方法可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测，具体包括：酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞粘附因子、植物凝集素、完整的病毒颗粒、病原菌等；也包括有机染料、金属离子、药物、氨基酸等小分子物质的检测。

实例1：

以重金属铅的核酸适配体筛选过程进行举例说明。

（1）铅离子及载体蛋白与DTPA的偶联

本实验主要通过异硫氰酸酷法和戊二醛法将金属离子通过双功能金属鳌合剂DTPA与载体蛋白偶联获得相应的偶联物。

异硫氰酷法:分别称取BSA 10mg溶于0.5ml HEPES缓冲液(10mM Hepes，pH 9.0 )，9.0 mg p-NH₂-Bn-DTPA溶于200μL的水中，称8mgPb(NO₃)₂溶于200μL 2%HNO₂中。