[发明专利]鮸鱼抗氧化蛋白Prx6基因的荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类抗氧化基因的特异性检测，具体地说，涉及鮸鱼抗氧化蛋白Prx6基因的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

鮸鱼抗氧化蛋白Peroxiredoxin6(Prx6)基因是近年来新发现的抗氧化剂家族的重要成员。Prx6蛋白是一个多功能蛋白，具有GSH过氧化物酶和磷脂酶A2活性。Prx6蛋白过氧化物酶活性催化区为PVCTTE，这一序列是Prx6蛋白仅有的。它属于Peroxiredoxin抗氧化超家族中的1-Cys成员，也是6类抗氧化蛋白中唯一的1-Cys类型的Peroxiredoxin。

Peroxiredoxin蛋白是一类新发现的具有显著抗氧化作用的酶系，主要包括硫氧化还原蛋白过氧化物酶(TPx)和烷基过氧化物还原酶C(Ahpc)等，它在清除活性氧族中具有重要作用。大量研究结果证明Prx6蛋白与特定疾病相关。Trudel等研究表明Prx6蛋白是纤维囊泡症(CF)抗氧化失效的关键因素，蛋白缺失引起氧化还原失衡。帕金森病、雅各病、匹克病、肺恶性间皮细胞瘤、鳞状上皮细胞癌、皮肤伤口愈合区、实验性早衰细胞等都发现与Prx6蛋白相关。

目前海水养殖业发展面临的病害问题日趋严重，特别是集约化养殖的发展经常导致急性病害爆发，给养殖业造成了巨大的经济损失。药物防治虽取得一定效果，但长期施药所致的环境污染以及诸多耐药性病原体的产生反过来又极大阻碍了产业的发展。因此改善养殖环境和提高鱼类自身的免疫防御成为亟待解决的问题。鱼类免疫系统对防止鱼体感染发挥着重要作用，尤其是在较短时间内可致鱼大量死亡的急性病害爆发中，特异性免疫机制尚不能在此时间内发挥有效功能，因而鱼类依靠快速、非特异性的先天免疫应答会有效地抵抗疾病。Peroxiredoxin蛋白是机体中重要的抗氧化因子，已有的研究表明，Peroxiredoxin蛋白具有GSH过氧化物酶和PLA2的双重活性,在机体抗氧化保护及肺表面物质代谢过程中具有重要作用。因此，对鱼类抗氧化蛋白基因Peroxiredoxin6的研究无疑能为提高鱼体在高密度人工养殖条件下的抗病、抗逆分子机制研究提供坚实的理论支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一种鮸鱼抗氧化蛋白Prx6基因的荧光定量PCR检测方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测鮸鱼抗氧化蛋白Prx6基因的荧光定量PCR引物对，其包括：

正向引物Prx6-RT-F：5’-GTATCCTGTTCTCCCACCC-3’和

反向引物Prx6-RT-R：5’-CAAGGCAATCATCTTCACG-3’。

本发明还提供用于检测鮸鱼抗氧化蛋白Prx6基因的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供一种鮸鱼抗氧化蛋白Prx6基因的荧光定量PCR检测方法，其是利用所述引物Prx6-RT-F和Prx6-RT-R，或含有该引物对的试剂盒对鮸鱼抗氧化蛋白Prx6基因进行荧光定量PCR检测。包括以下步骤：

1）提取样品组织中的总RNA，反转录成cDNA；

2）以步骤1）中的cDNA为模板，Prx6-RT-F和Prx6-RT-R为引物，进行荧光定量PCR扩增反应；

3）分析PCR产物。

荧光定量PCR反应体系以20μl计为：

荧光定量PCR反应条件为：在ABI 7300实时荧光定量PCR系统上进行反应，荧光定量反应程序模板设置为ddCt（Relative Quantitation）Plate，反应循环参数设置为：95℃ 20s；95℃ 5s，60℃ 30s，共40个循环，利用2^-△△CT法计算相对表达量。

优选地，在进行荧光定量PCR检测之前，还包括PCR特异性检测的步骤，具体为：

1）提取样品组织中的总RNA，反转录成cDNA；

2）以步骤1）中的cDNA为模板，Prx6-RT-F和Prx6-RT-R为引物，进行PCR扩增反应；

3）分析PCR产物。

PCR反应体系以25μl计为：

PCR反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟，共30个循环；72℃ 5分钟。