[发明专利]携带外源基因的复制型HBV载体、其转染后产生的重组HBV，和相应的制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，涉及一种病毒载体，尤其涉及一种携带外源基因的复制型HBV载体、其转染后产生的重组HBV，和相应的制备方法与应用。

背景技术

在全球范围内，乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染者超过4亿。这一人群发生肝纤维化，肝硬化，肝细胞癌的风险大大增加。现有的抗乙肝病毒药物，包括干扰素和核苷类似物两大类。但是这两类药物疗效均不理想，且干扰素副作用较大，核苷类似物易诱导HBV发生耐药突变。研发新型抗HBV药物的一大障碍就是缺乏良好的实验研究平台。

HBV特异性感染肝细胞，并且宿主范围极窄，仅能感染人、黑猩猩和树鼩。长久以来，来源于人或树鼩的原代培养肝细胞是仅有的两种HBV感染细胞模型。最近，研究人员培养出一种人肝癌细胞来源的HepaRG细胞，这种细胞在体外诱导分化之后，能够感染HBV。但是，HBV感染的分子机制，尤其是感染早期的相关细节，一直未被阐明。通过对转染细胞的研究，以及用生物化学方法重构HBV复制过程中的关键环节，人们对HBV复制的分子机制已有了较深入的了解。这些研究成果揭示了HBV基因表达产物和HBV基因组上众多顺式作用元件之间相互作用，以及这些相互作用是如何保证短小精悍的，基因结构高度紧凑的HBV完成其自我复制全过程的。正因为如此，即使对HBV基因组进行很小的基因工程改造，都可能严重干扰HBV的复制周期。

对于HBV以外的其他多种病毒，包括严重危害人类健康的人免疫缺陷病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）等，均可以用基因工程方法在病毒基因组上插入外源基因，如报告基因和筛选基因等，同时不干扰病毒自身的复制过程。通常这种经过改造的重组病毒经由与野生型病毒相同的方式感染宿主细胞，并且以相同的机制利用宿主细胞完成病毒复制。这些重组病毒上携带的外源基因的表达，依赖于病毒感染或病毒复制。这些外源基因的这种特性，使人们可以利用外源基因观察病毒感染的途径，快速测定病毒复制效率，探寻调控病毒感染和复制的宿主因素。更重要的是，通过外源基因的表达水平指示病毒复制水平的方法，为提供了一种快速筛选抗病毒药物的新策略，同时也可帮助分离鉴定对病毒易感的细胞。

由于HBV基因组结构和复制机制的特殊性，研发基于HBV的，既能表达外源基因，又能保留复制能力的新型载体，遇到了诸多困难。在HBV病毒颗粒中，多数HBV基因组以疏松环状DNA（RC DNA）的形式存在。少量HBV基因组以双链线性DNA（dsL DNA）形式存在。一旦感染细胞后，HBV RC DNA即转化为共价闭合环状DNA（ccc DNA），作为转录RNA的模板。如图1所示图中显示了HBV C基因，P基因，S基因，X基因的开放读框，HBV的DNA（“-”链和“+”链），增强子结构（Enh I和Enh II），转录出的基因组RNA和亚基因组RNA（genomic RNA和subgenomic RNA），以及RNA上的包装信号（ε）和poly A尾结构，从图中可以看出HBV基因组结构紧密，4种基因重叠，调控序列穿插其间。HBV基因组包含4个相互重叠的开放读框（ORF），分别是preS1/preS2/S，编码三种HBV外膜蛋白，大蛋白，中蛋白和小蛋白，这三种蛋白羧基端相同；preC/C，编码核心蛋白和对于复制非必需的前C蛋白，前C蛋白进一步剪切为分泌至细胞外的HBV e抗原（HBeAg）；X基因，编码X蛋白（HBx），发挥转录激活作用，对于感染过程至关重要；P基因，编码HBV聚合酶（Pol），是一个多结构域蛋白，包含逆转录酶活性区，RNA酶H区和蛋白-DNA相互作用区（末端蛋白区）。P基因ORF的长度约占HBV基因组的80%，与其他各个HBV的ORF重叠。HBV基因的表达需要通过4种RNA，均由HBV自身启动子调控转录，其中最重要的一条RNA是HBV前基因组RNA（pgRNA），pgRNA的长度超过HBV基因组本身，发挥双顺反子mRNA的功能，编码HBV核心蛋白，前C蛋白和P蛋白（即HBV聚合酶，Pol），同时，pgRNA还是逆转录生成HBV DNA的模板。在pgRNA上，启动子和增强子序列与ORF重叠，其他多个顺式作用元件也与ORF重叠，包括ε包装信号，以及两段直接重复序列（DR1和DR2），负责将pgRNA包装入新合成的HBV核壳，在pgRNA逆转录为RC DNA的过程中不可或缺。在这些调控区域上的任何位置插入外源序列，都将不可避免地严重破坏HBV基因组的精巧布局，并且将无可挽回地打破HBV复制的进程。