[发明专利]携带外源基因的复制型HBV载体、其转染后产生的重组HBV，和相应的制备方法与应用

权利要求书

1.一种携带外源基因的复制型HBV载体，其特征在于：它是在HBV病毒的基础上，利用分子克隆技术将HBV基因组上重叠的C基因和P基因分开，各自形成完整开放读框，其间插入蛋白翻译起始序列或蛋白酶切位点，分别引导外源基因和HBV P基因表达；

所述的外源基因的碱基对个数小于700bp；所述的蛋白翻译起始序列为内部核糖体进入位点的短小的碱基序列；蛋白酶切位点均为短小的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的携带外源基因的复制型HBV载体，其特征在于：所述的外源基因为miniSOG、绿色荧光蛋白、荧光素酶等荧光基团、杀稻瘟菌素抗性基因或博来霉素抗性基因中的一种；

所述的蛋白翻译起始序列为Rbm3 IRES或多拷贝9nt Gtx IRES；

所述的蛋白酶切位点为可发生“自我剪切”的2A肽。

3.一种制备如权利要求1或2所述的携带外源基因的复制型HBV载体的方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行：

一、第1轮PCR扩增

包括3个PCR扩增反应，目的分别为：

HBV的C/P基因重叠区与蛋白翻译起始序列的扩增；

外源基因的扩增；

蛋白翻译起始序列与HBV C/P基因重叠区的扩增；

二、三片段连接

3个PCR反应产物连接为依次包含C基因C端（包括C/P重叠区），翻译起始序列或蛋白酶切位点，外源基因，翻译起始序列或蛋白酶切位点，P基因N端（包括C/P重叠区）延伸超过HBV基因组上的EcoR I酶切位点的DNA双链；

三、第2轮PCR，扩增三片段连接产物

四、双酶切PCR产物，亚克隆至pCH-9/3093质粒Sal I-EcoR I位点，形成插入外源基因和翻译起始序列或蛋白酶切位点的HBV载体。

4.一种如权利要求1或2所述的携带外源基因的复制型HBV载体的应用，其特征在于：所述HBV载体用于构建HBV慢性感染动物模型、构建稳定自主复制HBV cccDNA的细胞模型和构建可示踪的HBV病毒株。

5.一种如权利要求1或2所述的携带外源基因的复制型HBV载体转染细胞后产生的重组HBV，其特征在于：所述重组HBV由携带外源基因的复制型HBV载体瞬时转染肝癌来源的细胞后，收集细胞培养上清中的病毒颗粒，即制得重组HBV，所述重组HBV的C基因和P基因完全分开，其间插入了可表达的外源基因，同时保留了复制和感染能力。

6.如权利要求5所述的携带外源基因的复制型HBV载体转染细胞后产生的重组HBV的一种制备方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行：

（21）构建如权利要求1所述的携带外源基因的HBV载体；

（22）利用步骤（21）中所制得的载体转染肝癌来源的细胞系，在细胞培养液中加入1-2%的二甲基亚砜，可明显提高重组HBV的复制水平及最终产量；其中，所述的肝癌来源的细胞系为HepG2或Huh7；

（23）收集细胞培养上清液，聚乙二醇8000沉淀上清液中的病毒颗粒。

7.如权利要求5所述的携带外源基因的复制型HBV载体转染细胞后产生的重组HBV的应用，其特征在于：所述重组HBV用于构建HBV慢性感染动物模型、构建稳定自主复制HBV cccDNA的细胞模型和构建可示踪的HBV病毒株。