[发明专利]一种胞质雄性不育系的快速创制方法

说明书

技术领域：

本发明涉及农作物育种技术领域。主要针对具有胞质雄性不育类型(CMS)的农作物，利用拟南芥早花基因(FLOWERING LOCUS T，即FT基因)诱导早花，快速创建可育种质相应的同型胞质雄性不育系。具体的涉及一种胞质雄性不育系的快速创制方法。

背景技术：

植物胞质雄性不育(CMS)是一种母性遗传性状，主要表现为植株不能产生有功能的花粉。胞质雄性不育系在农作物杂种优势利用以及杂交制种中可以免去人工去雄，简化制种工序，降低制种成本，保证杂交种子纯度，预防亲本流失，在产品是营养器官的作物的育种及品种应用推广中具有重要的应用价值。当前作物胞质雄性不育系的创制一般是通过常规回交育种的方式，以已有胞质不育系为母本，以待创制不育系的可育种质为轮回父本，经过连续多代回交创制而成。一般需要5-6年时间，即使利用常规温室加代技术，也需要3-4年才能创制一个可育种质的同型不育系。由于常规方法创制胞质雄性不育系时间比较长，使得一些尚没有不育系的优良种质、特别是新培育的优良定型品种的杂种优势利用更加费工费时，同时种质资源易流失，不利于品种知识产权的保护。如何快速创制胞质雄性不育系成为育种家比较关心的问题。

为解决上述技术问题，目前，有研究人员提出了植物不育系的创建方案。如，中国专利申请号2010102635769，公开了“植物雄性不育系及其恢复系的培育方法”，其培育植物雄性不育系具体方法为：是将表达盒的重组表达载体导入目的植物中得到雄性不育系植物：从上游至下游依次包括：loxp位点、花药或雄蕊器官原基特异启动子、乙烯受体ETR1蛋白的编码基因的反向互补基因、终止子和loxp位点。重组表达载体的构建方法是：将启动子和乙烯受体ETR1蛋白的编码基因的反向互补基因插入一中间载体的多克隆位点间(具体是：启动子插入EcoRI和SacI位点间；乙烯受体ETR1蛋白的编码基因的反向互补基因插入BglII和SpeI位点间)，得到重组表达载体；中间载体是将基因片段插入pCAMB2300质粒的多克隆位点间(如pvsI sta和SmaI酶切位点间)，得到中间载体。上述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，优选是拟南芥。

再如：中国专利申请号200910103255X公开了“一种植物基因工程雄性不育系的创建方法|”，具体为：结合Ssp DnaE intein内含肽、Barnase毒蛋白结构功能特点，创建能够自我繁殖的A系和B系，通过A系和B系之间的杂交使杂交后代表现不育进而创建不育系。

长期以来，人们一直利用常规育种的方法选育不育系，或者把不育性从一个品种转育到另一个品种中，这些方法周期长、见效慢，不能满足生产发展的迫切需要。目前，也有许多控制植物雄性不育性的基因被克隆，但是由于植物的不育性受核基因、线粒体基因、叶体基因和环境因素的影响，作用机理比较复杂，人们对其认识还不足，所以难在短期内获得明显的效果，因此，本发明旨在提供一种选育周期缩短，育性相对稳定，受环境影响小的一种胞质雄性不育系的快速创制方法。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种选育周期缩短，育性相对稳定，受环境影响小的一种胞质雄性不育系的快速创制方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种胞质雄性不育系的快速创制方法，其中，包括如下步骤：

A步骤：拟创制不育系的可育种质单拷贝早花植株的创建，选取杂交结果只有一条带的植株，作为备用植株提供下一步不育系的快速创制的操作；

B步骤：可育种质胞质雄性不育系的快速创制。

A步骤具体为：

(1)提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)RNA，反转录获得cDNA；

(2)在NCBI上查找拟南芥早花基因序列(＞gi|4903011|dbj|AB027504.1|Arabidopsis thaliana FT(FLOWERING LOCUS T)mRNA，complete cds)，从ORF两端设计引物，同时考虑后续表达载体所用的双酶切位点，在引物5’端加上酶切位点，

设计的引物为：F：5’酶切位点序列+ACCACCTGTTTGTTCAAGATC；R：5’酶切位点序列+GGTTATAAAGGAAGAAGCCAT；

(3)利用设计的引物，以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增，把扩增产物和MARKER分别点到1％琼脂糖胶上跑胶，扩增产物中574bp左右的片段就是早花基因片段；利用DNA纯化试剂盒直接对目标产物进行纯化；