[发明专利]一种胞质雄性不育系的快速创制方法

权利要求书

1.一种胞质雄性不育系的快速创制方法，其特征在于，包括如下步骤：

A步骤：拟创制不育系的可育种质单拷贝早花植株的创建，选取SOUTHERN杂交结果只有一条带的植株，作为备用植株提供下一步不育系的快速创制的操作；

B步骤：可育种质胞质雄性不育系的快速创制。

2.根据权利要求1所述胞质雄性不育系的快速创制方法，其特征在于，A步骤具体为：

(1)提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)RNA，反转录获得cDNA；

(2)在NCBI上查找拟南芥早花基因序列(＞gi|4903011|dbj|AB027504.1|Arabidopsis thaliana FT(FLOWERING LOCUS T)mRNA，complete cds)，从ORF两端设计引物，同时考虑后续表达载体所用的双酶切位点，在引物5’端加上酶切位点，

设计的引物为：F：5’酶切位点序列+ACCACCTGTTTGTTCAAGATC；R：5’酶切位点序列+GGTTATAAAGGAAGAAGCCAT；

(3)利用设计的引物，以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增，把扩增产物和MARKER分别点到1％琼脂糖胶上跑胶，扩增产物中574bp的片段就是早花基因片段；利用DNA纯化试剂盒直接对目标产物进行纯化；

(4)把纯化获得的拟南芥早花基因，按照常规通用的转基因技术，利用构建的不合GUS基因但含有筛选标记的表达载体，通过农杆菌介导转化拟创建不育系的农作物种质，获得转早花基因阳性植株；

(5)利用SOUTHERN杂交技术鉴定早花阳性植株中早花基因的拷贝数，筛选含单拷贝早花基因的植株备用。

3.根据权利要求1所述胞质雄性不育系的快速创制方法，其特征在于，B步骤具体为：

(1)选择已有的胞质不育系作为母本，以创建的拟转不育系的单拷贝早花植株为父本进行杂交，

(2)在F1群体中选择早花不育单株作为母本，以拟转不育系的非转基因正常可育株作为父本进行回交，

(3)在BC1F1群体及之后的回交世代中连续选择早花不育单株作为母本，以拟转不育系的非转基因正常可育株作为父本进行连续回交，直到回交至分离群体中非早花植株与轮回父本株型、主要植物学及农艺性状基本相同为止，优选为回交至BC5F1代，

(4)在BC5F1分离群体中选择优良的非早花不育植株，检测其是否含有FT早花基因、表达载体的Ubi启动子、终止子以及筛选标记序列，

(5)选择不含以上序列的非早花不育植株作为母本，以拟转不育系的非转基因正常可育株作为父本进行回交制种，获得的种子保存，即可作为可育轮回父本的同型不育系长期利用。

4.根据权利要求2所述胞质雄性不育系的快速创制方法，其特征在于，设计的引物具体为：

上游引物FTF：5′-AGAGCTCACCACCTGTTTGTTCAAGATC-3′

下游游物FTR：5′-CACTAGTGGTTATAAAGGAAGAAGCCAT-3′

以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增的操作中，PCR反应体系为：

扩增条件为：98℃预变性30s后，98变性℃10s，49℃退火5s，72℃延伸45s，循环30次后72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物即FT基因目的片段，用凝胶回收试剂盒回收获得的PCR产物，保存备用。