[发明专利]一种蛋白质或多肽的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体而言，涉及蛋白质或多肽的纯化方法。

背景技术

蛋白质的分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之中分离纯化出所需目的蛋白质的方法，在生物化学研究应用中使用广泛，是当代生物产业的核心技术。

蛋白质的分离纯化既要利用不同蛋白间内在的相似性，又要利用其差异，其中，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，以及利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物中提取出来。但是，目前蛋白质的分离纯化面临的技术问题在于：其技术难度高、成本高。例如，一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。

离子交换层析是蛋白质分离纯化中经常采用的一种技术，其利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定pH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。离子交换层析是在以离子交换填料为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换填料是由基质、电荷基团和反离子构成的，带有正电荷的称之阴离子交换树脂，阳离子交换树脂结合带有正电荷的蛋白质；而带有负电荷的称之阳离子树脂，阴离子交换树脂结合带有负电荷的蛋白质。离子交换层析的基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。离子交换填料与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换填料上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。洗脱方式可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。

为了使复杂的组分分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。更好的洗脱方法是连续梯度洗脱，但在实际生物医药工业化生产中，由于连续梯度洗脱对设备精度和操作人员技能依赖较高，会导致设备的初期投入较大，另外不同批次的纯化结果会受到操作人员主观判断的影响，因此不同批次间的重复性较差。因此，单纯的采用上述方法往往难以应对蛋白质分离纯化中各种复杂的情况。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种使离子交换层析填料同时具备离子交换层析和疏水层析的功能，进而高效纯化蛋白质或多肽的方法。

具体而言，本发明提供了一种基于离子交换层析的蛋白质分离纯化技术，其特点在于通过调节蛋白溶液的pH达到使目标蛋白与离子交换树脂相结合的目的，然后通过改变洗脱溶液中的有机相含量和离子浓度的方式将目标蛋白与杂质分别洗脱，本专利在使用离子交换树脂进行分离纯化的基础上，突破了离子交换层析的局限性，通过使用含有不同种类和浓度的有机相的缓冲液，使离子交换层析兼具离子交换层析和疏水层析的功能，从而简化的通过缓冲液的变化达到国外昂贵的新型层析填料才具有的复合层析分离效果。

众所周知，离子交换层析所使用的固定相表面应具有尽可能高的亲水性，以消除因疏水性对蛋白产生的非特异性吸附。在这种情况下，离子交换层析通常是采用改变洗脱溶液中离子浓度的方式将与离子交换固定相表面相结合的蛋白洗脱下来，对洗脱溶液中离子浓度的改变分为阶段洗脱和梯度洗脱两种方式；在某些情况下也会采用改变洗脱溶液pH的方式将与离子交换固定相表面相结合的蛋白洗脱下来，这种方式要求对洗脱溶液的pH控制精度较高，应用于大规模商业化生产有一定难度。另外，单纯采用上述方法往往难以应对蛋白质分离纯化中各种复杂的情况。本发明的独到之处在于不改变现有成熟的离子交换树脂，而对离子交换层析本身的洗脱方式进行改进，从而达到同时利用不同蛋白质特异的等电点和疏水性来对目标蛋白分离的目的。

因此，本发明提供了一种从包含目标蛋白质或多肽以及杂质的混合组分中提取出目标蛋白或多肽的方法，该方法包括依次进行的下列步骤：1）用与上样液一致或相似pH及电导率的缓冲液作为平衡液对离子交换填料进行平衡，使离子交换填料达到与上样液一致的pH与电导率，为上样做准备；2）调整待纯化蛋白溶液的pH，作为上样缓冲液，使目标蛋白可以被离子交换填料所吸附；3）用含有或/和不含有有机溶剂的第一缓冲液作为洗涤缓冲液，洗涤离子交换填料，从而从离子交换填料上洗脱下污染物；4）用含有有机溶剂的第二缓冲液作为洗脱缓冲液，洗涤离子交换填料，从而从离子交换填料上洗脱下目标蛋白。用含高盐浓度组分的缓冲液对吸附在离子交换填料的杂质蛋白进行洗脱，对离子交换填料进行再生。