[发明专利]一种调控干细胞体外三维定向分化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及再生医学领域，是一种调控干细胞体外三维定向分化的方法。

背景技术

干细胞由于具有自我更新和分化的能力，是损伤组织修复的理想种子细胞。但是当干细胞植入体内受损部位后，干细胞除了分化为所需要的组织细胞，参与组织修复，同时也分化为其它类型的细胞，甚至具有较高的致瘤性。对干细胞进行体外预分化，使之在移植之前预先分化为成熟的组织细胞或前体细胞，能够提高定向分化效率，减低干细胞在体内向其它类型细胞分化的能力，从而提高组织修复效果，并降低致瘤风险。

在体内细胞生长在细胞外基质所构成的三维网络中，研究表明体外二维培养条件下的细胞逐渐丢失了其表型和功能，而体外三维培养有利于细胞的功能维持，能够模拟体内特异组织细胞微环境，更好地促进干细胞体外的定向分化。目前，调控干细胞体外定向分化的三维体系，采用了脱细胞支架、胶原支架、或聚乳酸支架等，这些支架有的具有较高免疫原性，有的缺乏促分化的特殊细胞外基质成分，有的降解产物不利于细胞培养以及组织修复，这导致了干细胞体外定向分化效率低，获得细胞不具有体内正常生理功能等问题。

由于现有诱导分化体系存在上述缺陷，严重限制了干细胞体外定向分化技术的进一步发展与临床应用，因此急需研发便捷实用的诱导干细胞三维分化的新方法，即通过利用三维培养以及添加基质成分来构建能够模拟体内组织的微环境，以实现体外对干细胞定向预分化的调控，进一步促进干细胞在再生医学领域的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控干细胞体外三维定向分化的方法，即利用含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠实现对干细胞体外定向分化的调控。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明将干细胞包埋在含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠中，添加诱导分化培养液，通过改变制备微胶珠时海藻酸钠和硫酸软骨素的质量比调控干细胞体外定向分化，并且在分化结束后，可利用柠檬酸钠溶液溶解海藻酸钙微胶珠，进而得到纯净的分化细胞。

所述干细胞包括胚胎干细胞、iPS细胞、间充质干细胞、神经干细胞、虹膜色素上皮细胞、羊膜上皮细胞、或造血干细胞。

所述含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠为由含海藻酸钠和硫酸软骨素的溶液经过钙液钙化所制备，此溶液溶剂为生理盐水，海藻酸钠浓度为0.3-4%(W/V)，硫酸软骨素溶液浓度为0.5-10%(W/V)，海藻酸钠和硫酸软骨素的质量比为1-20；

含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠直径为200-2000μm；

海藻酸钠的分子量为100-1000kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比例（GM比）范围为0.2-3，且海藻酸钠为未修饰海藻酸钠、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（RGD）修饰海藻酸钠、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（IKVAV）修饰海藻酸钠、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸（YIGSR）修饰海藻酸钠中一种或二种以上的海藻酸钠；

硫酸软骨素平均分子量为2-40kDa；

所述定向分化包括干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨或脂肪细胞定向分化。

所述定向分化所使用的培养容器为静态培养体系或生物反应器；

静态培养体系指使用培养瓶、培养板、培养皿、或培养袋培养；

生物反应器包括旋转式反应器、灌注式反应器、搅拌式反应器、或气升式反应器。

本发明具有如下优点：

1．操作简单，成本低。本发明利用含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠对干细胞体外定向分化进行调控，方法简单，避免使用昂贵材料和工艺；

2．模拟体内特异组织分化微环境，提高干细胞分化效率和功能。三维海藻酸钙微胶珠为干细胞提供了三维生长环境，并且硫酸软骨素的添加进一步模拟了体内组织的细胞外基质成分，因此本发明能够在近似于体内特异组织微环境的条件下诱导干细胞分化，其诱导效率和细胞功能进一步提高；

4．高活性收集分化细胞。在分化结束后，利用柠檬酸钠溶液溶解微胶珠，通过离心可在生理条件下收集分化的细胞，细胞活性高，功能不受影响；

5．应用范围广。本发明方法可促进干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨或脂肪细胞定向分化，并可放大培养规模，具有临床应用前景。

附图说明

图1为本发明的示意图：培养容器1，含有硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠2，干细胞3；

图2为含有20%(W/V)硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠中细胞的软骨特异性染色；