[发明专利]一种营养繁殖花卉水仙超低温保存及植株再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及到一种植物种质资源的保存及植株再生方法，，尤其涉及到一种营养繁殖花卉的超低温保存及植株再生方法，具体的说是涉及到一种崇明水仙的超低温保存及植株再生方法,属植物细胞工程技术领域。

背景技术

崇明水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）是上海市特色花卉品种之一，早在明朝就有栽培。它花香优雅、花期长，株型矮小，园林上适合配植在草地边缘或布置花坛、花境，具有广泛应用前景，近年来已销售国际市场。在常规生产及保存过程中，由于病毒病严重及种源退化，严重阻碍了崇明水仙的产业化发展：因崇明水仙为同源三倍体，具高度不孕性，无法通过种子保存资源。通常采用鳞茎在圃地保存的方式，并通过分离小籽球的方法进行繁殖，１个种球1年仅能繁殖 3～4 个籽球，年繁殖系数低。此外，我国水仙病毒病危害非常严重，作为种源用的鳞茎在长年持续栽培下，病毒积累日益严重，造成产量逐年萎缩，种性退化，失去观赏价值和商品性。通过组织培养保存除了需定期继代，需要大量人力及物力外，还有污染及品种退化的危险。因此，建立一套经济高效的崇明水仙种质保存体系，探索快速、有效、稳定的崇明水仙离体脱毒方法，对有效保护崇明水仙种质资源,提纯复壮、加速产业化进程具有现实意义。

超低温保存是指在液氮（-196℃）下的低温保存。在此条件下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择。它避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。关于植物超低温保存的研究，在进入到20世纪90年代后，保存技术的多样化与简易化方面不断取得进步，能够保存的植物物种数也在不断地增长，但多数集中在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等薯类植物为主的植物遗传资源的超低温保存。在超低温保存技术方面，崇明水仙属球宿根植物，目前对此类植物中百合及大蒜的相关报导较多，水仙同科（石蒜科）植物中，上海市农业生物基因中心（申报单位）已对红花石蒜成功进行超低温保存并申请相关专利（中国：CN1934941: 2007）。

发明内容

本发明的目的是提供一种营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生方法。

为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是提供一种营养繁殖花卉的超低温保存及植株再生的方法，所述超低温保存方法包含以下步骤：将营养繁殖花卉的鳞茎进行诱导，切取大小2~5mm的茎尖，将所述带有根原基和芽原基的茎尖进行预培养，然后置于预处理溶液中在室温下处理15～30min，将预处理溶液中处理过的茎尖转入玻璃化保护剂中进行冰浴处理60～120min，将冰浴处理的茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，然后将冷冻管迅速投入到液氮中保存。

本发明采用的优选实施方案是，所述的营养繁殖花卉为崇明水仙。

本发明采用的优选实施方案是，所述诱导包含的步骤有：选取3～4年生崇明水仙鳞茎；将崇明水仙的鳞茎用70%酒精消毒1 min，0.1%的升汞消毒10~20min，然后用无菌水冲洗；将冲洗过的鳞茎切块接种于含1 mg·L^-1 BA及1 mg·L^-1 NAA的MS培养基上诱导出小鳞茎。

本发明采用的优选实施方案是，所述MS培养基上诱导的培养温度为23～27℃, 光照12 h·d^-1，光照强度36 μmol m^-2 s^-1，继代为3个月。

本发明采用的优选实施方案是，所述预培养是指将诱导后的茎尖接种到含0.3~0.5 mol·L^-1蔗糖的MS培养基内在25℃下培养1~5天。

本发明采用的优选实施方案是，所述预处理溶液为2 mol·L^-1甘油和0.4 mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基。

本发明采用的优选实施方案是，所述玻璃化保护剂为3.26 mol·L^-1甘油、 2.42 mol·L^-1乙二醇、1.9 mol·L^-1 DMSO和0.4 mol·L^-1蔗糖。