[发明专利]一株嗜铅菌的克隆与培养

说明书

技术领域

本发明涉及高效吸附铅菌株的筛选，PCR方法进行鉴定，目的菌在体内外环境中吸附效率的测定，动物铅中毒造模，ICP-MS法测定Pb²⁺含量，所筛选的乳酸菌吸附效率高，检测方法检出限低，灵敏度高。

背景技术

环境持久性污染物尤其是重金属对空气、水源及土壤的污染日趋严重已成为不争事实。重度污染区域的饮水，蔬菜、水果和粮食等农作物，以及动物源食品中重金属含量超标已在所难免。如何阻抗和减少重金属在动物和人体内的蓄积与危害是亟待解决的重大课题。因此，我们团队开展了本项研究。

目的菌的筛选与鉴定采用传统的技术和快速鉴定技术相结合，使用乳酸菌选择性培养基，并在其中添加不同浓度的Pb²⁺，初步筛选出具有高抗铅性和高吸附性的菌株，经过生化鉴定试剂盒和16SrDNA序列分析法对筛选的菌株进行鉴定。16SrDNA扩增使用通用引物，PCR扩增片段约为1500bp，命名为Q  dk/m-1

所筛选的目的菌在体内外吸附试验中，吸附效率高，体外吸附试验模拟胃肠道环境。而体内吸附试验使用家兔作为试验对象，首先是铅中毒造模阶段，造模成功后，按照动物体重饲喂铅清除剂。

与原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、原子发射光谱法相比，电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定Pb²⁺检出限低、灵敏度和精密度高、选择性好以及可以同时检测多元素，被认为是目前最灵敏的检测方法，已经广泛应用于食品、环境、药品、生物样品等领域的分析研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是筛选出一株具有高效吸附铅性能的乳酸菌，为研制一种铅抵抗益生菌制剂，有效减少Pb²⁺在动物和人体的积累提供技术储备。

本发明的技术方案是从动物的体内筛选出铅抗性的乳酸菌，经过一系列的生化鉴定，利用通用引物进行PCR扩增鉴定。通过发酵培养添加到动物饲料中，测定其对动物体内铅的清除作用，用ICP-MS方法测定血液、粪便、肌肉、内脏组织中的Pb²⁺。

附图说明

附图是本发明所述的铅抗性乳酸菌的克隆及培养流程图，具体实施方式：

1．耐铅乳酸菌的筛选

无菌采集动物肠道及粪便样品，利用传统的细菌分离技术在

MRS乳酸菌选择性培养基中进行分离，首先在含有不同Pb²⁺浓度的MRS液体培养基中尽心耐铅性驯化，选择筛选出耐铅浓度大于400mg/l的菌株。

2．铅高效吸附菌株的筛选

将筛选的耐铅菌株进行吸附效率测定，将目的菌接种于含Pb²⁺浓度为100mg/l的MRS液体培养基中37℃，140r/min振荡6h后测定Pb²⁺含量。

3．目的菌株的生化鉴定

采用乳酸菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定，挑取一环活化的菌

株接种于试剂管中，倒插于泡沫板上，37℃温箱中培养24h。

4．乳酸菌基因组提取

将保存的目的菌于LB中活化，采用CTAB/NaCl法提取乳酸菌

DNA。通过SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分。

5．扩增引物

16SrDNA扩增采用通用引物，正向引物为27f：

5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1541r：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′。

6．PCR扩增

     在优化的PCR反应条件下进行PCR扩增，得到一段大小为1500bp的DNA产物。

反应条件为预变性94℃，5min；变性：94℃，1min，退火：58℃，1min，延伸：72℃，2min，30个循环；延伸：72℃，10min，4℃保存。

25ul PCR反应体系，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 终物质的量为2pmol，Mg2+ 终物质的量为32.5pmol，1.25U Taq 酶、引物1、引物2引物终物质的量均为5pmol。

7．体外吸附试验

模拟人工胃液和人工肠液的吸附环境进行Pb²⁺吸附试验。

8．动物体内试验

选择家兔为试验对象，先进行铅中毒造模试验，造模成功后，