[发明专利]一株嗜铅菌的克隆与培养

权利要求书

1.筛选鉴定的具有重金属铅吸附性的乳酸菌，是通过传统的细菌筛选方法从鸡的肠道及其排泄物中筛选得到的，由于该菌株是从动物肠道中筛选得到的，稳定性好，无致病性，可以在动物肠道内定殖等优点，减少进入肠道内重金属铅被机体吸收而蓄积于体内组织脏器；

方法如下：

步骤一，耐铅菌株的驯化，传统筛选

步骤二，高效吸附铅菌株筛选

步骤三，引物设计

步骤四，PCR扩增

步骤五，吸附液的制备

步骤六，动物体内吸附实验

步骤七，ICP-MS法测定铅含量

该菌株的特点是耐铅浓度高、稳定好、吸附效率高、安全性高。

2.根据权利要求1所述驯化及筛选方法，所筛选的目的菌为乳酸菌，所以选择乳酸菌选择性培养基MRS琼脂，其方法是首先在含低浓度（50mg/l）铅的MRS液体培养基中培养，再依次增加浓度进行驯化100，150，200mg/l，驯化的耐铅菌株在含铅的MRS琼脂平板上为白色圆菌落；分离纯化的耐铅菌株分别接种在含Pb²⁺ 0，250，300，350，400mg/l的液体培养基中，目的菌株可以耐受的Pb²⁺≥400mg/l。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，通过测定菌株在培养基中

以及模拟胃肠道环境中对铅的吸附，筛选出高效吸附性的目的菌，其方法是筛选抗铅菌株按照1%的接种量接种于MRS液体培养基中培养18-24h达到生长对数期，取2ml培养液12000r/min离心10min收集菌体，菌体沉淀分别加入到10mlMRS液体培养基，10ml模拟胃肠道环境的液体中，37℃，140r/min摇床吸附2h后离心取出菌体，上清液定容至50ml后测定铅的浓度；

人工胃液的配制方法：9.5%-10.%的盐酸16.4ml，加水稀释使PH达到3.0；

每100ml溶液中加入1.0g胃蛋白酶，混匀，用0.2um无菌滤膜过滤；

    人工肠液的配制方法：称取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml溶解，用0.4%的氢氧化钠溶液调PH至6.8，加水稀释至1000ml，每100ml液体中加入1.0g胰蛋白酶混匀，用0.2um无菌滤膜过滤。

4.根据权利要求1所述的筛选方法，16SrDNA扩增采用通用引物，正向引物为27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1541r：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′。

5.根据权利要求1所述的PCR反应条件，其特征是在该反应条件下，目的基因的扩增效果很好，所述反应条件为预变性94℃，5min；变性：94℃，1min，退火：58℃，1min，延伸：72℃，2min，30个循环；延伸：72℃，10min，4℃保存；25ul PCR反应体系中，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 终物质的量为2pmol，Mg2+ 终物质的量为32.5pmol，1.25U Taq 酶、引物1、引物2引物终物质的量均为5pmol。

6.根据权利要求1所述的吸附液的制备，方法是按1%的接种量接种于LB肉汤中，37℃，140r/min摇床培养至菌体的浓度为10⁹cfu/ml，于4℃保存备用。

7.根据权利要求1所述的动物体内吸附实验，由于家兔适应性强，不易生病，价格合理等因素，故选择家兔为实验对象，其体重为2.21±0.2kg，饲喂一周观察健康后随机分组，每组6只，进行铅中毒造模，按照3mg/kg体重，饲喂5mg/ml的醋酸铅溶液，造模过程中每3天耳动脉采血测定血铅含量，不造成家兔体重明显变化，不降低其食物利用率，至血铅水平＞600ug/l时停止铅染毒；

造模成功后，任然饲喂铅模拟每天通过饮食和饮水摄入体内的铅，同时，每天早上9:00根据家兔采食量的一半，实验组饲喂不同剂量的铅清除剂（乳酸菌吸附液）5ml/d，对照组饲喂相同剂量的饮用水，然后再添加充足的饲料，在清除过程中每一周耳动脉采血测定血铅浓度，并测定粪便铅的含量；3周后每组处死一半，采集血液、粪便、肝脏、心脏、肾脏、脑、肌肉、脂肪测定铅含量。

8.根据权利要求1所述的铅含量测定中，样品经过湿法消解后，采用7700X电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS），ICP-MS方法检出限低、干扰少、灵敏度高；铅元素校正曲线的相关系数R达到0.9999，方法检出限为0.02205ppb。