[发明专利]一种利用Flag蛋白标签沉淀目的蛋白的染色质免疫共沉淀技术

说明书

技术领域

本发明应用到一种研究DNA与蛋白质相互作用的染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)，涉及到构建目的蛋白上带有Flag蛋白标签的表达载体并用其抗体沉淀DNA-蛋白复合物的方法。

背景技术

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)是一种在体内研究转录因子(DNA)与靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子结合位点的信息，确定其直接靶基因。此项技术早期多被用于研究核小体上DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来，染色质免疫共沉淀技术(ChIP)已经得到了许多改进和完善，成为一种被用于研究体内转录调控因子与靶基因启动子上特异DNA序列相互作用的广泛使用的技术。ChIP技术已经成为在染色质水平上研究基因表达调控的最为有效的方法。值得一提的是，此项技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量测序筛选已知目的蛋白与其相互结合的靶基因在全基因组上的分布情况。这将有助于寻找出更多的转录因子，为研究疾病的发病机制探明道路。

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原-抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA片段，再通过多种下游检测技术(定量PCR、基因芯片、高通量测序等)来检测此富集片段的DNA序列。

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)的灵敏度最终取决于从未结合的片段背景中分离蛋白质结合的DNA片段的能力，其中抗体的质量和IP步骤是关键。然而，蛋白质和基因组DNA的非特异性结合会产生不同种类的背景，这些背景能被交联捕获且不受IP步骤改进的影响。因为较短DNA片段的非特异性结合位点较少，所以非特异性结合水平会随着DNA片段长度的减少而降低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对在染色质免疫共沉淀中出现的抗体质量差而导致的特异性低的问题而提出的一种全新的方法。

本方法是首先需要构建一个目的蛋白基因带有Flag蛋白标签序列的真核表达载体，检测构建成功的表达载体是否在细胞内表达；其次将构建好的表达载体转染进特定的细胞内；最后将细胞用甲醛交联，超声破碎，用Flag蛋白标签抗体(而非目的蛋白抗体)去沉淀目的蛋白与下游靶基因的复合物，后续其他步骤同传统的染色质免疫共沉淀技术。具体地说，本方法包括如下步骤：

1.构建载体：在NCBI上查找出目的蛋白的基因序列，PCR扩增出目的片段，将扩增出的目的片段克隆进一端带有Flag序列的真核表达载体。

2.检测构建的载体是否表达：提取质粒，将其瞬时转染进特定细胞内48小时，提总蛋白做Western Blot检测是否表达。

3.将构建好的表达载体转染进特定细胞内：如果步骤2证明构建的表达载体可以表达，再进行此步骤。根据不同的细胞类型和表达量的不同，选用瞬时转染或稳定转染，将构建的表达载体转染进特定细胞内，待其在细胞内表达量达到预计程度后再进行步骤4。

4.甲醛交联细胞：本步骤同传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)，主要是用甲醛将细胞内的蛋白质-DNA、蛋白质-蛋白质固定下来。

5.超声破碎：本步骤同传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)，主要是用超声破碎仪将蛋白质-DNA复合物中基因组DNA打碎到一定的长度范围内，一般情况下是200bp-1kb。

6.用Flag蛋白标签抗体(而非目的蛋白抗体)去沉淀目的蛋白与下游靶基因的复合物：本步骤是此项方法的核心步骤。传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)是用目的蛋白抗体去沉淀目的蛋白与下游靶基因的复合物，它所存在的最大问题是抗体沉淀的效率低和抗体使用量大，而且抗体非常昂贵，然而，此项方法却是用Flag蛋白标签抗体代替目的蛋白抗体去沉淀目的蛋白-下游靶基因复合物。由于Flag蛋白标签抗体特异性非常好，而且抗体价格昂贵，所以本方法解决了传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)所面临的抗体效率低和抗体使用量大且昂贵的问题，大大节省了费用。

7.后续操作步骤都同传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)。

本方法具有如下的优点和效果：

1.本方法首先是构建了一个过表达体系去做染色质免疫共沉淀，因为提高了目的蛋白在细胞内的表达量，所以可以用来研究细胞内低表达的目的蛋白所调控的下游靶基因位点。