[发明专利]制备模块融合蛋白表达产物的方法

说明书

本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2006/060065，国际申请日为2006年10月19日，进入中国国家阶段的申请号为200680038790.6，名称为“制备模块融合蛋白表达产物的方法”的发明专利申请的分案申请。

本申请的主题涉及申请号60/728,259，60/803,913，60/821,682，60/821,958，10/682,764(US2004/0185556，PCT/US2004/013517，WO2005/040336)，11/233,246和US20040572011P(WO2005116231)。这些专利和申请各自通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及分子生物学方法和实施该方法的产品。更具体地说，本发明涉及编码模块型蛋白质的核酸的克隆方法，所述模块可顺序加入预定位置。

背景技术

本领域已知克隆核酸的重组DNA技术和分子生物学方法。这种方法包括利用限制性内切酶、连接酶、核苷酸/核苷激酶和磷酸酶、聚合酶及其它分子生物学工具操作核酸，从而产生所需的重组核酸。已出版的几种实验室手册可以作为分子生物学研究者的参考书籍。这些参考手册的例子包括：Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社；Joseph Sambrook和David Russell，2001，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第三版，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社。

本领域的问题之一是缺乏方法来工程改造嵌合蛋白质表达产物，而能方便地将模块元件插入嵌合体内所需位置。总之，虽然已成功制备了杂交或嵌合蛋白质，但合成的目的是为在终产物(不想局限于预定的机制)中加入更多的模块。本发明的一方面考虑到嵌合体及其变体的未来需求和能制备它们而无需每个都从头开始以解决该问题。本发明的一个实施方式总体上涉及制备融合蛋白表达产物的方法。本发明的另一实施方式涉及含有预先经工程改造的模块型融合蛋白表达产物的制备方法。本发明另一方面涉及构建区段分子或模块，这种模块预先设计成能插入嵌合蛋白质表达盒。本发明还涵盖了可用于所披露方法的工程改造模块的文库。一个实施方式制备了含有预定限制性位点的模块。

发明内容

本发明涉及制备模块型嵌合蛋白表达产物的方法和该方法所用的组合物。具体地说，本发明涉及顺次、定向克隆编码多肽模块的多核苷酸。各可克隆元件含有侧接预定的限制性位点的开放读框。这些方法包括利用可克隆元件和含有这些元件的载体作为重组DNA技术的起始材料。本发明的优点之一是能快速而方便地制备许多融合蛋白变体，而无需设计和评估后续的各克隆步骤。

本发明的一个实施方式通常涉及制备融合蛋白表达产物的方法。本发明的另一实施方式涉及含有组合模块的融合蛋白表达产物的制备方法。本发明另一方面涉及构建嵌段分子或模块，这种模块预先设计成能插入嵌合表达盒。本发明还涵盖了可用于所披露方法的模块文库。一个实施方式制备了含有预定限制性位点的模块。

各可克隆元件或模块含有编码感兴趣开放读框，例如但不限于：全长蛋白质或多肽、或功能域、结构域、酶结构域、抑制区、结合区、定位信号、表位、外显子、或其它所需的亚成分的多核苷酸序列。可从国家医药图书馆获得有关模块蛋白质信息的数据库，其称为保守性结构域数据库或CDD，该数据库代表了可根据蛋白质家族和物种之间保守的氨基酸序列同源性来鉴定结构域的一种来源。

全长蛋白质的非限制性例子包括激酶、激酶亚基、磷酸酶、磷酸酶亚基、肽配体、蛋白酶、蛋白酶亚基、酶亚基、DNA结合蛋白亚基、g-蛋白亚基、离子通道亚基和膜受体亚基，仅是举例。

功能域的非限制性例子包括DNA结合区、转录激活区、二聚体化功能域、催化域、磷酸化区、调节区、死亡结构域、普列克底物蛋白同源结构域、脂质结合区、激素结合区、配体结合区、锌指区、亮氨酸拉链区、g-蛋白结合区、糖基化区、酰化区和跨膜区，仅是举例。

结构域的非限制性例子包括α螺旋区、β片尾区、酸性区、碱性区、疏水区、链内二硫键区(intra-chain disufide bonding domain)、辅因子结合区和金属离子结合区，仅是举例。