[发明专利]一种杀菌肽CAD的重组表达及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉一种天蚕素杀菌肽的表达及制备方法，尤其涉及一种天蚕素杀菌肽Cecropin AD（CAD）的重组表达及其制备方法。

背景技术

杀菌肽（anti2microbial peptides）是具有抗菌活性短肽的总称。1981 年瑞典科学家Steiner等从惜古比天蚕（Hyatophora cecropia）蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，并将其命名cecropin。杀菌肽一般含有37～39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。天蚕素(cecropins)对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力，而对真菌和真核细胞没有毒性。

天然存在的天蚕素杀菌肽分为cecropin A、cecropin B和cecropin D，其中天蚕素杀菌肽AD是由cecropin A和cecropin D设计合成的37个氨基酸的杂合肽，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。该抗菌肽分子具有独特的广谱抗菌活性，体外试验已证明它能有效的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等有害菌，因此，它成为抗生素替代物的绝佳选择之一。随着研究工作的深入开展，发现某些抗菌肽会对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有很强的杀伤作用，并且在其它领域也具有很好的应用前景。 

目前，国内外在杀菌肽AD的基因工程方面开展了不少研究工作，有关杀菌肽基因在大肠杆菌、酵母、昆虫杆状病毒载体表达系统、以及哺乳动物细胞中的表达研究均已有报道。黄亚东等利用昆虫杆状病毒表达系统表达了天蚕杀菌肽AD（黄亚东，中国抗生素杂志，2003，28:304-307）。而使用昆虫病毒载体系统表达目的蛋白质，实验步骤繁琐，条件不易于控制，不适合大规模生产。黄亚东采用PCR技术改造杀菌肽AD基因，构建了酵母重组分泌型表达载体，用Pichia pastoris 系统表达了杀菌肽AD（黄亚东，华南理工大学自然科学版，2003,30:13-16）。但酵母表达系统不仅培养密度低，杀菌肽的表达量有限，而且杀菌肽表达酰胺化不完全，影响其抗菌活性，同时酵母表达系统具有生产周期长，生产成本高的缺点。中国专利CN101307316A 公开了抗菌肽CAD在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及重组枯草杆菌表达系统，但研究表明枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶比较多对目的蛋白易降解，并且给纯化目的蛋白带来困难。

迄今为止，主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业规模生产蛋白质的宿主菌细胞。大肠杆菌的主要优点是：遗传背景清楚，易于遗传操作并能保持转化株的稳定性；经大体积培养可获得高产率的表达产物；带有易于纯化的标签蛋白；细胞易于培养，且培养周期短，从而可降低生产成本等优点。由于杀菌肽的组成特点，仅由氨基酸组成，不含外源成分及化学修饰，不需要翻译后加工修饰，可以采用原核表达系统进行表达。但杀菌肽对大肠杆菌有很强的毒性，分子量较小不能直接进行表达，需要借助融合蛋白来封闭杀菌肽的毒性。然而，使用大肠杆菌生产生物学活性蛋白质的另一个重要缺点是，表达产物在宿主胞浆内形成包涵体，即无生物活性的不溶性聚合体。为了克服原核表达容易形成包涵体的缺点，人们常采用融合表达，希望在大肠杆菌中高效表达外源蛋白。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种杀菌肽CAD的重组表达；

本发明的另一目的是提供一种杀菌肽CAD的制备方法。

本发明杀菌肽CAD的重组表达，是以pUC18为表达载体，以大肠杆菌E.coli ER 2566为宿主，以天蚕素杀菌肽CAD的基因与分子伴侣β-半乳糖苷酶Abg蛋白标签融合，合成编码Abg-CAD的融合基因重组表达。 

所述融合基因的核苷酸序列为：