[发明专利]一种杀菌肽CAD的重组表达及其制备方法

权利要求书

1.一种杀菌肽CAD的重组表达，是以pUC18为表达载体，以大肠杆菌E.coli ER 2566为宿主，以天蚕素杀菌肽CAD的基因与分子伴侣β-半乳糖苷酶Abg蛋白标签融合，合成编码Abg-CAD的融合基因重组表达。

2.如权利要求1所述天蚕素杀菌肽AD的重组表达，所述融合基因的核苷酸序列为：

ATGGGCGGCCATCATCATCATCATCATGGCGGCAATGTTCTTCTGCTGATTTGCTATGGCGGCGATTATAATCCGGAACAATGGCCGGAAGAAATTTGGTATGAAGATGCAAAACTTATGCAAAAAGCAGGCGTTAATCTTGTTCTGCTTGGCATTTTTCTGTGGCTGAAAATTGAACCGCTGGATGGCGTTTTTGATTTTGAATGGCTTGATAAAGTTATTGATATTCTTTATGATCATGGCGTTTATATTAATCTTGGCACAGCAACAGCAACAACACCGGCATGGTTTGTTAAAAAATATCCGGATCTGCTTCCGATTGATGAACTGGGCCTTAAAGCAGTTGTTTGCCTGTGCAGACTTGTTAGAGTTGGCAATTGCCTTATTGGCGGCGTTCTGTTTTGCAGAAGAACAGAACTTTTTACATATTGCTGCACAAGAGTT；

其氨基酸序列为：

MGGHHHHHHGGNVLSSICYGGDYNPEQWPEEIWYEDAKLMQKAGVNLVSLGIFSWSKIEPSDGVFDFEWLDKVIDILYDHGVYINLGTATATTPAWFVKKYPDSLPIDESGLKAVKWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK。

3. 如权利要求1所述杀菌肽CAD的制备方法，包括以下工艺步骤：

（1）将天蚕素杀菌肽CAD的基因与分子伴侣β-半乳糖苷酶Abg蛋白标签融合，合成编码Abg- CAD融合蛋白的融合基因； 

（2）用限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ对杀菌肽的Abg- CAD融合基因进行双酶切，并与同样用限制性内切酶双酶切的表达载体pUC18质粒连接，构建一种表达毒性蛋白的表达载体；

（3）将表达载体转化至大肠杆菌E.coli ER 2566，获得基因工程菌；

（4）通过培养基因工程菌组成型表达获得融合蛋白Abg-CAD；

（5）融合蛋白Abg-CAD分离纯化后，通过Factor Xa蛋白酶酶切，纯化，获得杀菌肽CAD。

4.如权利要求3所述杀菌肽CAD的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的标签融合，是采用固相亚磷酰胺三酯法合成如下片段：在Abg DNA序列的N-末端连上亲和层析纯化标签6×His的DNA序列；在其C-末端连上Factor Xa蛋白酶识别位点Ile-Glu-Gly-Arg和目的蛋白CAD的DNA序列，并在整个融合DNA序列的5’端和3’端分别加上EcoRI和PstI酶切位点及相应保护碱基。

5.如权利要求3所述杀菌肽CAD的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述通过培养基因工程菌组成型表达获得融合蛋白Abg-AD的工艺为：将筛选的基因工程菌单克隆，接种到LB+Amp培养基中，于温度37℃、摇速225 rpm下振荡培养10～12h；再按5%的比例转接到新鲜培养基中，于温度30℃、摇速225rpm下培养至菌液OD为0.6～0.8，0.5mM的IPTG诱导10～12h；离心收集菌体，加入裂解液，超声破菌后离心，取上清液，进行Ni-NTA亲和层析，再经洗涤、洗脱，即得含Abg-AD的可溶性融合蛋白。

6.如权利要求5所述杀菌肽CAD的制备方法，其特征在于：所述裂解液是由Tris-HCl缓冲液，pH8.0的NaCl溶液，pH8.0的CaCl₂溶液组成的混合体系；其用量为：在50ml混合体系中，20mM Tris-HCl，100mM NaCl， 2mM CaCl₂； 1mg的Factor Xa酶加入 50mg融合蛋白底物，25℃温育不超过6小时。

7.如权利要求3所述天蚕素杀菌肽CAD的制备方法，其特征在于：所述超声破菌的工艺：在超声波的功率400w下，超声2s，停2s，共20～40个周期。

8.如权利要求3所述杀菌肽CAD的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述Factor Xa蛋白酶酶切获得杀菌肽CAD的工艺为：在分离纯化后的融合蛋白中加入Factor Xa蛋白酶，于25℃进行酶切反应，检测酶切完全后的融合蛋白进行Ni-NTA亲和层析，收集穿透液，即得纯化后的杀菌肽Abg-CAD。