[发明专利]体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法

说明书

技术领域:

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种软骨分化的方法，特别是一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法。

背景技术:

近些年来，使用滑膜间充质干细胞进行半月板软骨修复是关节外科的热点问题。经典的组织工程学方法是将体外增殖诱导干细胞形成种子细胞，种植种子细胞在生物支架上，将支架移回生物体并添加各种细胞因子进行修复。

既往许多研究者选择骨髓间充质干细胞（bone marrow-dervied mesenchymal stem cells，BMSCs）作为种子细胞。但是当De Barii发现了滑膜间充质干细胞（synovium-dervied mesenchymal stem cells，SMSCs）后，其迅速取代了BMSCs。原因在于：尽管SMSCs在细胞形态、免疫表型、集落形成能力和分化潜能方面和BMSCs相似，但其具有更强的软骨分化潜能；此外，生理上当半月板出现损伤时，滑膜作为SMSCs的储存器，会移行定植到损伤处,和局部细胞一起，完成修复过程。所以选择SMSCs，更符合生理过程，并有更专一的软骨分化潜能。

目前为止，有个案报道研究者采用转化生长因子3（TGF-β3）和骨形成蛋白2（BMP-2）作为介导SMSCs向软骨分化的诱导因子。Sakaguchiii、Shirasawaiii和Horie Miv等利用TGF-β3、BMP-2和地塞米松（Dex），成功诱导SMSCs向纤维软骨分化。但这一过程中仍存在诸多问题：诱导所需的BMP-2浓度需要非常高（50～200g/L甚至更高)，且时间很长，这就导致SMSCs有向骨分化的可能。且体外反复应用细胞因子存在降解失活的可能，并大大增加培养费用。所以在本发明的实验中，采用慢病毒介导兔BMP-2基因转染SMSCs，并加入EGFP基因作为报告基因，从而为应用组织工程学方法进行软骨修复提供新思路和新方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，所述的这种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法要解决现有技术中体外诱导滑膜间充质干细胞向软骨分化的方法成功率低、而且时间和成本高的技术问题。

本发明提供了一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，包括一个将滑膜间充质干细胞分离、培养的步骤，还包括一个构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤，一个制备转染慢病毒的病毒液的步骤，一个将转染慢病毒转染滑膜间充质干细胞的步骤，在所述的构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤中，首先根据BMP-2基因设计引物，通过逆转录反应扩增BMP-2基因，将已经包含EGFP报告基因的pFUGW质粒和BMP-2基因重组，构建重组质粒pFUGW-oBMP-2，在所述的制备转染慢病毒的病毒液的步骤中，利用所述的重组质粒pFUGW-oBMP-2加上包装质粒，共同构建转染慢病毒，然后再加入缓冲液培养、孵育、移去上清、过滤后得到转染慢病毒的病毒液，在所述的将转染慢病毒转染滑膜间充质干细胞的步骤中，取第三代以上的滑膜间充质干细胞和解冻的转染慢病毒的病毒液混合，将混合物离心、培养40-52小时，然后将上述的培养物加入不完全成软骨诱导培养液诱导培养液中诱导，诱导14天以上即可获得软骨细胞。

进一步的，在所述的制备转染慢病毒的病毒液的步骤中，首先扩增重组质粒pFUGW-oBMP-2、包装质粒psPAX2和pMD2.G，提纯浓缩；其次将293T细胞的细胞密度调至10⁷，放入培养瓶中培养，所述的培养瓶内含有DMEM培养基，所述的培养基中还包含有青霉素G、链霉素、小牛血清、聚赖氨酸，所述的青霉素G在DMEM培养基中的浓度为100U/ml、所述的链霉素在DMEM培养基中的浓度为100μg/ml、所述的小牛血清在DMEM培养基中的质量百分比浓度为10%、所述的聚赖氨酸DMEM培养基中的浓度为5%，将293T细胞于培养瓶孵育后加入含有pFUGW-oBMP-2、psPAX2、pMD2.G的缓冲液，孵育、移去上清、过滤后得到转染慢病毒的病毒液。

进一步的，在所述的构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤中，将oBMP-2的cDNA用Age1和Nhe1双酶切，同时，将已经包含EGFP报告基因的pFUGW用Age1和Nhe1双酶切，然后加入T4DNA反应得到pFUGW-oBMP-2重组质粒。