[发明专利]体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法

权利要求书

1.一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，包括一个将滑膜间充质干细胞分离、培养的步骤；其特征在于：还包括一个构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤，一个制备转染慢病毒的病毒液的步骤，一个将转染慢病毒转染滑膜间充质干细胞的步骤，在所述的构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤中，首先根据BMP-2基因设计引物，通过逆转录反应扩增BMP-2基因，将已经包含EGFP报告基因的pFUGW质粒和BMP-2基因重组，构建重组质粒pFUGW-oBMP-2，在所述的制备转染慢病毒的病毒液的步骤中，利用所述的重组质粒pFUGW-oBMP-2加上包装质粒，共同构建转染慢病毒，然后再加入缓冲液培养、孵育、移去上清、过滤后得到转染慢病毒的病毒液，在所述的将转染慢病毒转染滑膜间充质干细胞的步骤中，取第三代以上的滑膜间充质干细胞和解冻的转染慢病毒的病毒液混合，将混合物离心、培养40-52小时，然后将上述的培养物加入不完全成软骨诱导培养液诱导培养液中诱导，诱导14天以上即可获得软骨细胞。

2.如权利要求1所述的一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于：在所述的制备转染慢病毒的病毒液的步骤中， 首先扩增重组质粒pFUGW-oBMP-2、包装质粒psPAX2和pMD2.G，提纯浓缩；其次将293T细胞的细胞密度调至10⁷，放入培养瓶中培养，所述的培养瓶内含有DMEM培养基，所述的培养基中还包含有青霉素G、链霉素、小牛血清、聚赖氨酸，所述的青霉素G在DMEM培养基中的浓度为100U/ml、所述的链霉素在DMEM培养基中的浓度为100μg/ml、所述的小牛血清在DMEM培养基中的质量百分比浓度为10%、所述的聚赖氨酸DMEM培养基中的浓度为5%，将293T细胞于培养瓶孵育后加入含有pFUGW-oBMP-2、psPAX2、pMD2.G 的缓冲液，孵育、移去上清、过滤后得到转染慢病毒的病毒液。

3.如权利要求1所述的一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于：在所述的构建重组质粒pFUGW-oBMP-2的步骤中，将oBMP-2的cDNA用Age1和Nhe1双酶切，同时，将已经包含EGFP报告基因的pFUGW用Age1和Nhe1双酶切，然后加入T4 DNA 反应得到pFUGW-oBMP-2重组质粒。

4.如权利要求1所述的一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于：在扩增BMP-2基因的过程中，所述的5’端的引物序列如SEQ ID NO :1所示，所述的3’端的引物序列如SEQ ID NO :2所示。

5.如权利要求1所述的一种体外慢病毒介导BMP-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于：所述的不完全成软骨诱导培养液培养液是一个含TGF-β₃、地塞米松、2-磷酸-抗坏血酸、脯氨酸、丙氨酸、1：100稀释的ITS+Premix溶液的H-DMEM培养液；其中，在所述的H-DMEM培养液中，TGF-β₃的浓度为10 ng/mL、地塞米松的浓度为1×10^-7 mol/L、 2-磷酸-抗坏血酸的浓度为50 μg/mL、脯氨酸的浓度为40 μg/mL、丙氨酸的浓度为100 μg/mL、所述的1：100稀释的ITS+Premix溶液中含有胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、牛血清白蛋白、亚油酸，在所述的1：100稀释的ITS+Premix溶液中，胰岛素的浓度为6.25 μg/mL、转铁蛋白的浓度为6.25 μg/mL、亚硒酸的浓度为6.25 ng/mL、牛血清白蛋白的浓度为1.25 mg/mL、亚油酸的浓度为5.35 mg/mL。