[发明专利]提高黄瓜子叶节离体再生及转化率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程，特别涉及一种通过筛选黄瓜最优苗态做外植体，提高黄瓜子叶节离体再生和转化率的方法。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.)，为葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属，一年生蔓生或攀援草本植物。其果实食用方便，脆嫩多汁，风味独特，果菜兼用，营养价值极高，甚至可用于美容，深受现代人喜爱。近年来，黄瓜育种目标集中在品质、抗逆和抗病虫方面，以提高单位面积产量而获取更大的经济效益。由于黄瓜遗传基础狭窄，存在远缘杂交障碍，因此利用基因工程技术将是今后黄瓜品种改良的有效手段。此外，因黄瓜花性型分化多样，黄瓜已逐渐成为研究植物性型分化的模式材料。当前，越来越多的研究者加入到黄瓜分子育种和以黄瓜为研究材料的相关分子生物学研究领域。尤其是黄瓜基因组测序的完成，加速了黄瓜分子育种和相关分子生物学研究的进程，而植物基因工程则是进行上述研究的核心手段。目前，植物上一般采取以农杆菌介导的遗传转化系统进行转基因操作，因此，成熟且稳定的植物组织离体再生培养和遗传转化体系成为利用植物基因工程进行遗传改良和分子育种的瓶颈。

黄瓜的离体再生培养和遗传转化研究始于1979年，影响黄瓜再生及遗传转化的因素诸多，包括基因型、外植体类型、苗态、植物生长调节剂、农杆菌菌株及活性、外力(如超声波的使用)、酚类物质的使用、预培养时间、侵染时间、共培养时间、芽诱导的选择压、生根选择压等。目前，研究者已对黄瓜子叶、子叶节、真叶、下胚轴、胚根等进行了再生植株的研究，但仍存在出芽率、再生率和转化率低下等一系列问题，严重阻碍了植物基因工程在黄瓜分子遗传改良上的应用。

赵军良[1996，山西农业科学，黄瓜子叶组织培养再生植株]对六个黄瓜品种的子叶和下胚轴(培养基为BA和NAA的MS培养基)进行了研究，结果发现子叶基部能直接分化出不定芽，而子叶的上部分则不能再生，下胚轴也不能分化，认为最适宜的黄瓜外植体为子叶节。侯爱菊[2003，园艺学报，诱导黄瓜直接器官发生主要影响因素的研究]和杜胜利[2000，天津农业科学，苗龄、基因型和外植体类型对黄瓜离体器官发生的影响]等也得到类似结果。在黄瓜子叶节离体再生系统中，ABA与激动素相配合可促进植株分化。Sekioka等研究表明在黄瓜的组织培养中，低浓度ABA可促进胚状体的正常发育[1981，Hort Science Differentiation in callus culture of cucumber(Cucumis sativus L.)]，控制胚状体处于球形胚或球形胚后期[陈峥等，2001，天津农业科学，提高黄瓜农杆菌遗传转化体系再生频率的研究]。在植物组织培养过程中，细胞生长会产生并累积乙烯，进而影响细胞的分化，硝酸银中Ag⁺为乙烯活性抑制剂，能竞争性地结合于乙烯作用部位，减轻了乙烯的作用，从而促进植物器官发生和体细胞胚胎发生[Mohiuddin A K M，1997，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Influences of silver nitrate oncucumber in vitro shoot regeneration；高武军，2002，中国农学通报，硝酸银在油菜基因转化中的影响作用]。曹利仙等研究表明，AgNO₃能显著地提高黄瓜芽再生频率，以2.0mg/L AgNO₃效果最为明显[2001，甘肃农业大学学报，硝酸银对黄瓜离体子叶培养芽再生的促进效应]。外植体的大小是影响子叶节再生频率的重要内在因素之一。外植体大小研究方面主要以苗龄为依据，认为最佳苗龄为1-7d的均有报道，由于同样苗龄的外植体，其生理状态并不相同，且一般情况下黄瓜种子的发芽率和发芽势也有差异，所以采用不同苗态黄瓜子叶节更趋合理。

发明内容

本发明的目的，是为了提供一种提高黄瓜子叶节离体再生及转化效率的方法，研究不同苗态对黄瓜遗传转化效率的影响情况，筛选出对黄瓜遗传转化最有利的苗态，及再生率高的最优培养基，丰富黄瓜离体再生体系，为今后黄瓜遗传转化体系的建立提供理论和技术基础。

本发明所采取的技术方案如下：

一种提高黄瓜子叶节离体再生及遗传转化率的方法，包括以下步骤：

(1)选择两片子叶刚脱离种壳的黄瓜子叶节为外置体；

(2)在步骤(1)所得黄瓜子叶节基部轻轻划上伤口；