[发明专利]一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法

说明书

技术领域

本发明属于SNP检测技术领域，尤其涉及一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法。

背景技术

单核苷酸多态性（SNP）标记技术，属于新一代的标记技术。常用来表示不同生物个体在同一等位基因处个别碱基的差异，常常出现的单核苷酸多态性有碱基替换、碱基的插入缺失。目前，SNP是所发现的生物中存在最广泛的变异类型，即使在不同生物个体中序列差异不大的基因中也存在一定数量的SNP位点，因此是植物遗传研究中理想的分子标记。作为新兴的分子标记，SNP有如下优点：数量多分布广，SNP比微卫星标记密度更高，是等位基因间序列差异最为普遍的类型；SNP具有二态性特点，其不再以DNA序列长度的不同来检测多态性，能够用不同的方法进行基因的检测；在启动子区的SNP可能对基因的表达造成影响，而在编码序列的SNP可能会影响到所编码蛋白的结构和功能，是目前遗传研究的热点。

目前，检测SNP的方法很多，常用的有如下几种：利用生物信息学的方法在已有的DNA数据库中搜索SNP，这种方法比较直接、快捷；单链构象多态性（SSCP），通过个别碱基的变化影响DNA的构象的原理来检测SNP，操作简单、经济、适用面广。但影响因素较多，如电泳温度、凝胶浓度均可影响其灵敏性，所以稳定性不高；酶切法，基因中个别碱基的变化，可造成原来基因中部分酶切位置的变化，通过特异酶切割所扩增的序列，产生大小不一的切割片段，再利用简单的检测手段来可达到区分该位点的目的。酶切检测法方便、准确，但只能分析酶切位点处的SNP，而不能检测酶切位点以外的SNP，所以有一定局限性；杂交法，如DNA芯片技术，可以大大提高检测速度，但价格较昂贵；测序法，对不同个体等位基因片段进行测序分析，检测序列中的碱基变异。该法直观、准确，但工作量大，价格昂贵；PCR法，利用引物序列3′端的SNP不能与模板有效结合，导致PCR扩增结果的不一，通过特定的手段检测PCR结果来达到确定SNP位点的目的。PCR法方便快捷但受较多其它因子的干扰，重复性较差。利用SNP标记，人们已成功标记了一些抗病、抗逆和优质基因（Buren etal.2000；Brooks et al.2006；Mondini et al.2012）。

从以上方法可以看出，目前常用的方法存在稳定性不高、有一定局限性、价格较昂贵、重复性差等。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，在获得基因序列后，针对该基因的变异开发相应的功能标记，对研究基因的功能并有效利用该基因提供坚实的基础。

本发明实施例是这样实现的，一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，该方法将所发现的SNP位点设计在引物3′位置；该方法通过两次PCR，再通过技术检测PCR结果，确定出个体SNP位点的基因型。

进一步，该方法引物设计方法为：

两个个体相同的基因处有一个T碱基和C碱基的替换，由Allele1特异位点T设计特异引物P1，同样由Allele2特异位点C设计特异引物P2；两对引物在Genotype1中扩增时，P1引物能够正常扩增出PCR产物，P2引物不能正常扩增而没有PCR产物，确定该基因的基因型为TT；用相同的方法扩增可以确定Genotype2基因型为CC；若两者都能得到扩增产物，可确定Genotype3基因型为TC，从而分析出SNP位点。

本发明提供的方法针对由于平常所用的TaqDNA聚合酶要进行正常扩增，其5′可以不需要与模板完全匹配，而其3′要求完全配对。针对这个特性，可以特异地将所发现的SNP位点设计在引物3′位置；针对突变型的基因设计的引物与野生型的基因会形成3′端错配，导致不能正常扩增；同样以野生基因设计的引物与突变型基因的3′端产生错配，也同样在突变型个体基因组中不能正常扩增。本发明通过两次PCR，再通过特定技术检测PCR结果，可以方便地知道该个体SNP位点的基因型。

附图说明

图1是本发明实施例提供的等位基因特异PCR技术原理

图2是本发明实施例提供的AS-PCR引物设计；黑体表示加入的错配碱基；

图3是本发明实施例提供的AS-PCR引物组合筛选

图4是本发明实施例提供的部分F₂后代基因分型结果；泳道1-20为F₂代第300-319个单株的基因型结果；