[发明专利]桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法。 

背景技术

最近二十年，羽扇豆烷系列化合物的三萜类用于多种疾病的治疗。其中桦木醇为主要的一种三萜类化合物，广泛地分布在自然界中，并且被应用于好多领域。因此已有大量文献报告桦木醇及其衍生物研究和应用的有重要性。桦木醇及其衍生物的分子结构如下： 

其中，1为桦木醇结构式，2为桦木酸3为齐噋果烷结构式；在这些三萜类化合物中桦木醇是极其重要的一种，因为桦木醇及其衍生物表现有良好的生物学活性。 

桦木醇和桦木酸是两种天然化合物对各类瘤株的抑瘤率达到30%以上,对黑色素瘤B16的效果最好，抑瘤率为51.4%，桦皮素可促进巨噬细胞和脾细胞分泌肿瘤坏死因子(TNE)，增加巨噬细胞的细胞毒性活性。桦皮素的生物学功能包括：抗肿瘤、抗炎抗菌（尤其抗肺结核菌）、抗病毒（尤其艾滋病毒）、抗突变，抗衰老、抗氧自由基，抗缺氧，有戒毒作用，增加免疫机能，护肝保肝等功能。临床试验发现，桦木酸极有可能开发成抗癌药物应用于肝癌、肠癌、胃癌的治疗。另外桦皮素具有极强的抗结核杆菌作用，可用于治疗结核病。最近研究确定桦木醇调控血液中胆固醇，脂肪酸的含量和调节机体对胰岛素的敏感性，同时可减缓动脉粥样硬化斑块的形成，具有重要的研究开发于临床应用价值。现有制备桦木醇，分离桦木酸的方法存在纯度不高，收率较低的问题。 

发明内容

本发明的目的是为了解决现有制备桦木醇，分离桦木酸存在转化不高和收率较低的问题，而提供了桦木醇的分离纯化及桦木酸的化学和生物转化方法。 

本发明的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，是按照以下步骤进行的： 

一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表 面pH至中性，然后在105℃温度下干燥1~2h，得处理原料； 

二、在温度为75℃条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为50~60℃条件下过滤，收集滤液，在温度为4℃条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品； 

三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液，在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成； 

四、在液体培养基中加入菌培养细胞进行预备培养，得到预备培养液；向预备培养液中加入步骤三得到的桦木醇结晶品，然后在温度为25℃~30℃、转速为200r/min的条件下，发酵培养18h，得到桦木酸转化液，向桦木酸转化液中加入正己烷，混合均匀，过硅胶层析柱，收集柱层析液，重结晶，得到桦木酸；其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:10~15mL；步骤四中所述的桦木醇结晶品与预备培养液的质量体积比为1g：9~11mL，桦木酸转化液与正己烷的体积比为1：1，所述的菌为优化的黄绿蜜环菌； 

其中，所述的黄绿蜜环菌的菌种优化方法如下： 

a、选取黄绿蜜环菌的出发菌株，重悬，吹干，取镜检无细胞重叠出发菌株置于水冷靶台上平皿内进行N+离子注入，注入能量为20keV；注入剂量为60×2.6×10¹³~200×2.6×10¹³ions／cm²、靶室真空度为2×10^-3Pa，脉冲注入时间为5s，注入时间间隔为55s，然后用无菌水洗脱，稀释，涂分离平皿，在恒温箱中温度为28℃条件下，培养4~5d，挑选与出发菌菌落形态不同的单菌落转接于斜面培养基上，在温度为28℃的条件下，活化培养4~5d，制成含孢子数约10⁵~10⁷cfu／mL的孢子悬浮液； 

b、将孢子悬浮液按1%的接种量接种于发酵液体培养基中，在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养2d，再加入底物溶液，继续在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养4d，测定发酵液中桦木酸的含量，筛选出桦木酸转化得率高于黄绿蜜环菌出发菌株40-50％的高转化率菌株，进行连续传代5次，即完成黄绿蜜环菌的菌种优化；