[发明专利]桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物和化学转化方法

权利要求书

1.桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法是按照以下步骤进行的：

一、取桦树皮原料粉碎，水洗后，浸入质量百分含量为2%的氢氧化钠溶液中，在温度为200~240℃，压力为1.2~3.4MPa的条件下处理3~5min，冷却至室温后，用水淋洗桦树皮原料表面pH至中性，然后在105℃温度下干燥1~2h，得处理原料；

二、在温度为75℃条件下，采用质量百分含量为95%乙醇对步骤一得到的处理原料进行回馏提取2h，重复回馏提取1次，合并提取液，将提取液蒸发浓缩至1/20体积，在温度为50~60℃条件下过滤，收集滤液，在温度为4℃条件下结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇粗品；

三、将步骤二得到的桦木醇粗品用8倍体积的溶液溶解，滤出沉淀，收集上清液，在温度为4℃的条件下重结晶，收集结晶物，减压干燥，得到桦木醇结晶品；其中，溶液是由氯仿:无水乙醇按体积比为1:20的比例混合而成；

四、在液体培养基中加入菌培养细胞进行预备培养，得到预备培养液；向预备培养液中加入步骤三得到的桦木醇结晶品，然后在温度为25℃~30℃、转速为200r/min的条件下，发酵培养18h，得到桦木酸转化液，向桦木酸转化液中加入正己烷，混合均匀，过硅胶层析柱，收集柱层析液，重结晶，得到桦木酸；其中，步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:10~15mL；步骤四中所述的桦木醇结晶品与预备培养液的质量体积比为1g：9~11mL，桦木酸转化液与正己烷的体积比为1：1，所述的菌为优化的黄绿蜜环菌；

其中，所述的黄绿蜜环菌的菌种优化方法如下：

a、选取黄绿蜜环菌的出发菌株，重悬，吹干，取镜检无细胞重叠出发菌株置于水冷靶台上平皿内进行N+离子注入，注入能量为20keV；注入剂量为60×2.6×10¹³~200×2.6×10¹³ions／cm²、靶室真空度为2×10^-3Pa，脉冲注入时间为5s，注入时间间隔为55s，然后用无菌水洗脱，稀释，涂分离平皿，在恒温箱中温度为28℃条件下，培养4~5d，挑选与出发菌菌落形态不同的单菌落转接于斜面培养基上，在温度为28℃的条件下，活化培养4~5d，制成含孢子数约10⁵~10⁷cfu／mL的孢子悬浮液；

b、将孢子悬浮液按1%的接种量接种于发酵液体培养基中，在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养2d，再加入底物溶液，继续在温度为28℃、转速为120r／min的条件下培养4d，测定发酵液中桦木酸的含量，筛选出桦木酸转化得率高于黄绿蜜环菌出发菌株40-50％的高转化率菌株，进行连续传代5次，即完成黄绿蜜环菌的菌种优化；

所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，按质量百分含量计是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖、3％的琼脂和余量的水组成；

发酵液体培养基，按质量百分含量计是由30％的马铃薯、2％的葡萄糖和余量的水组成；

底物溶液为质量百分含量为90％的桦木醇溶解于二甲基亚砜而成的浓度为7~8mg／mL的溶液。

2.根据权利要求1所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于步骤四中所述的预备培养具体操作如下：取4mm²~5mm²斜面培养菌丝体，采用无菌水将黄绿蜜环菌丝体稀释成孢子数含量为10⁶cfu/mL的孢子悬浮液，将孢子悬浮液按1%的接种量接种于液体培养基中，在转速为120r/min，温度为25℃~30℃的条件下恒温振荡培养48h，得预备培养液；其中，液体培养基为马铃薯综合培养基，按质量百分含量计，是由2％的可溶性淀粉、1％的葡萄糖、0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.3％的尿素、0.2％的KHPO₄、0.1％的MgSO₄·7H₂O、0.003％的FeSO₄和余量的水组成，pH为7.0。

3.根据权利要求1所述的桦木醇的分离纯化及桦木酸的生物转化方法，其特征在于步骤二中所述的处理原料与质量百分含量为95%乙醇的质量体积比为1g:5~8mL。