[发明专利]基于纳米金催化的共振散射光谱四环素检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种食品安全技术领域的方法，具体是一种利用被适配体包裹的纳米金催化产生氧化亚铜增强共振散射光谱检测牛奶中四环素浓度范围为0.0095–2.5μmol/L，最低检测限为9.5nmol/L的四环素的方法。

背景技术

四环素是一种常见的抗生素类药物，但是随着使用量的增加，其在动物性食品和环境中的残留问题引起了广泛的关注。环境中的四环素残留可以增强微生物耐药性甚至超级细菌的滋生，还可通过食物链在动植物中富积；动物性食品中四环素的残留危害表现为慢性毒性危害，但是长时间的摄取可能会导致各种器官的病变甚至某些过敏体质会因此而产生变态反应。所以，建立高灵敏度、高选择性的四环素检测方法显得尤为重要。

传统的四环素检测方法有仪器分析法如高效液相色谱、毛细管电泳、气质联用技术等；免疫分析法如酶联免疫等；微生物抑制法等等。其中仪器分析方法虽然准确可靠，但是实际应用中需要昂贵精密的仪器以及专业的技术操作人员，费时费力，难以满足大规模应用及实时原位检测的需求。免疫分析方法和微生物抑制法虽然成本廉价但是却容易出现假阳性，结果不可靠。

最近研究发现，四环素可以与特定核酸适配体（DNA序列）特异性结合。其相互间的高亲和性可以使其形成稳定的适配体-四环素复合物。同时，许多文献报道DNA容易覆盖在纳米金表现，使纳米金形成稳定的分散体系，被DNA覆盖后的纳米金仍具有很强的催化活性；而裸露的纳米金在高浓度NaCl的作用下会聚集，聚集后的纳米金催化活性很低可以忽略。这为利用四环素适配体和纳米金检测四环素提供了理论依据。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于纳米金催化的共振散射光谱四环素检测方法，克服核酸适配体需要修饰及检测线不理想等缺陷，提供一种灵敏、选择性好、成本低且高效的四环素检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种四环素光敏性的实现方法，通过将四环素适配体和纳米金混合后加入四环素溶液，然后通过加入氯化钠溶液进行聚集反应，最后与含有硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠的溶液混合，使得混合后得到的产物在620nm波长处的共振散射信号的变化量与四环素浓度呈反比例关系。

上述加入四环素溶液后混合液中四环素的浓度范围为：0.0095–2.5μmol/L；

所述的四环素适配体溶液通过以下方式制备得到：将定制合成好的含有1.29nmol四环素适配体的离心管在10000转每分钟的离心机下离心2分钟，然后向离心管中加入258μL超纯水溶解混合均匀，制成5μmol/L的四环素适配体，置于4°C冰箱保存备用。

所述的纳米金溶液是指：向100mL沸腾的0.01wt%的氯金酸中加入3.5mL1.0%的柠檬酸酸三钠溶液，加热煮沸搅拌30分钟，溶液颜色由灰色变为亮红色，停止加热并继续搅拌至冷却，然后用0.2μm超滤膜过滤。所得溶液即为纳米粒径为15nm的纳米金，并置于4°C冰箱保存备用。

所述的氯化钠溶液为500mmol/L，检测时体系添加7μL。

所述的硫酸铜为0.028mol/L，检测时体系添加10μL；氢氧化钠为6.25mol/L检测时体系添加100μL；酒石酸钾钠为1.23mol/L，检测时体系添加200μL；葡萄糖为10mg/mL，检测时体系添加50μL。

本发明涉及一种基于纳米金催化的共振散射光谱四环素检测方法，通过构建含有已知四环素浓度的检测体系后，荧光光度计进行共振散射光谱信号扫描得到共振散射信号变化量标准曲线，然后将待测对象与超纯水，即对照样分别加入含有四环素适配体和纳米金的混合液，并通过加入氯化钠溶液进行聚集反应，最后与含有硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠的溶液混合，最后经荧光光度计进行共振散射光谱信号扫描得到共振散射信号变化量标准曲线得到待测对象中的四环素浓度。

所述的检测体系通过以下步骤制备得到：

1)制备已知浓度的四环素检测体系：取11支包含四环素核酸适配体与纳米金混合液的离心管，在25℃条件下孵育15分钟；然后分别加入5μL不同浓度四环素标准液，使得整个检测体系中的四环素含量维持在0.0095-2.5μmol/L，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育15min；在上述混合液中加入7μL 500mmol/L NaCl溶液充分混合均匀并定容至500μL，留作以下测定用。

2)取一支离心管将四环素标准溶液用5μL超纯水替代，其他按步骤1处理后作为空白对照体系溶液。